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「青莲聚焦」精准药物表征，助力新药研发!生物药表征之二
人阅读 发布时间：2021-08-19 13:37
01排阻色谱法纯度测定
排阻色谱法（Size Exclusion Chromatography，SEC）又称尺寸排阻色谱法、分子排阻色谱法、凝胶排阻色谱法、空间排阻色谱法，是液相色谱的一种主要分离模式。主要用于分离大分子，从而实现高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试，还可分离油溶性和水溶性物质。目前，SEC技术正被越来越多的应用于天然聚合物、合成聚合物和蛋白质的分离与表征，生物药的纯度是生产质控的重要指标之一。
仪器构造
HPLC-SEC系统主要由溶剂输送系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理系统组成。操作简便快捷、数据可靠且重现性好，自动化程度高。
排阻色谱的色谱柱填料是凝胶，凝胶表面有不同尺寸的多孔网状结构，小分子物质进入色谱柱时由于扩散作用进入凝胶内部被滞留，大分子物质通过时被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒间迅速通过，从而实现分子筛效应，将混合物按照分子量大小分开。分子量越小离开色谱柱的时间越长，依据色谱峰是否单一来判断样本的纯度。
结果展示
色谱图-数据采集系统将检测器响应为色谱图中保留时间的函数，对色谱图下的峰进行积分确定峰面积，该峰面积与样本中组分存在浓度成正比。使用高效液相进行纯度分析。依据色谱峰的保留值进行定性分析；根据色谱峰的峰面积或者峰高进行定量分析；根据色谱峰的单一性来判断样本的纯度。
送样标准
蛋白质样品可以是干粉、溶液；蛋白纯度>95%；蛋白质量>500 μg，浓度0.5μg/μL以上；
02SDS-PAGE
SDS-PAGE-十二烷基硫酸钠聚凝胶电泳，是最常用的蛋白表达分析技术，是对蛋白质进行量化、比较以及特性鉴定的一种经济、快速、可重复的方法可以用于鉴定蛋白的表达情况（表达量和表达分布）以及分析目的蛋白的纯度等。
技术原理
SDS-PAGE主要利用聚acrylamide凝胶的分子筛效应分离蛋白质，测定分子量的大小。聚acrylamide凝胶是由单体acrylamide和交联剂在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
在凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠)，有变性剂与助溶剂的作用，和蛋白的疏水部分结合，破坏其折叠结构，从而让多肽变性，使蛋白质带负电，削弱了蛋白质电泳时电荷和分子量大小的因素。当分子在15-200KD时，蛋白质的迁移率和分子量的对数称线性关系。分子量越小，迁移速率越快。
应用范围
蛋白质纯度分析、分子量测定、浓度测定、免疫沉淀蛋白鉴定、蛋白质修饰鉴定、分离和浓缩用产生抗体的抗原、分离放射性标记的蛋白质。
结果展示
送样标准
蛋白质样品可以是干粉、溶液；蛋白纯度>95%；蛋白质量>20 μg，浓度0.5μg/μL以上；
03CE-SDS
CE-SDS(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate)十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳，因快速高效、灵敏度高，在生物大分子纯度分析方面取代了平板凝胶电泳，相比传统的电泳实验，自动的紫外-可见光检测器针对物质吸收进行信号检出与定量，避免了分离介质品质不均一、染料定量判定不严格的缺点，提供了更优的精密度与分离度。目前，毛细管电泳在生命科学、食品安全、环境保护等领域应用非常广泛，主要用于生物技术药物的纯度分析、等电点以及电荷异质性分析、糖基分析。
原理
毛细管内充满凝胶，凝胶会在毛细管内形成分子筛。毛细管两端通高电压，以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，使凝胶内带电分子移动到毛细管相反电荷的一端，因为不同分子的大小以及电荷比不同，以不同的速率在管中移动，依此探测、分离样本。
v=uE
（v:电场迁移速率；u：电流淌度；E电场强度=V/L,V=电压，L=毛细管总长度）
结果展示
CE-SDS方法基于蛋白分子量的差异分离，用于还原和非还原单抗药物的纯度分析，免去了复杂的人工操作、定量更加准确，具有更高的分辨率，在还原模式中可对非糖基化重链进行分离和准确定量。
CE-SDS对还原单克隆抗体药物的纯度分析
CE-SDS的优势
1、所需样本量少、仪器简单、操作简便。
2、分析速度快、分离效率高、分辨率高、灵敏度高。
3、无需制胶，省时省力，也无需照胶，避免人工误差。
4、安全、废液少比较环保。
送样标准
蛋白质样品可以是干粉、溶液；蛋白纯度>95%；蛋白质量>50 μg，浓度0.5μg/μL以上。
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