哈喽，亲爱的小伙伴们，我们又见面啦，继最近一周阿尔兹海默症系列文献分享之后，此次给大家带来的是科研领域的“明星”外泌体在阿尔兹海默症中的研究案例，接下来我们一起看看外泌体如何助力阿尔兹海默症相关细胞类型分析！

 

 

 

研究背景

阿尔茨海默病（AD）是一种普遍存在的神经退行性脑病，其特征是大脑中存在淀粉样斑块和tau神经原纤维缠结，但在斑块沉积过程中分子和细胞变化仍然难以捉摸。中枢神经系统中的每种细胞都分泌外泌体(EV)，其内容物随着AD疾病状态而发生改变，可以反映疾病特异性的分子特征。从患者来源的生物流体或活检中捕获细胞类型特异性EV，并分析其内容作为研究AD病理生理学的一种新方法，大多项目对患者血浆或血清中免疫捕获脑细胞衍生的EVs进行了研究，但由于人类样本中细胞类型特异性EV蛋白质组数据集的信息目前有限，因此缺乏细胞特异性EV标记物。

为解决以上问题，Tsuneya Ikezu研究团队在J Extracell Vesicl（IF 21.224）杂志上发表了题为“Human neural cell type-specific extracellular vesicle proteomedefines disease-related molecules associated with activated astrocytes in Alzheimer’s disease brain”的文章，证明了细胞类型特异性EV在评估AD进展中的重要作用，并为未来神经退行性疾病的EV研究提供了资源。

主要研究内容如下：

1.研究了干细胞诱导分化的四种不同的神经细胞类型（兴奋性神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞）分泌的EV的蛋白质组学特征，确定了新的细胞类型特异性EV蛋白标记物。

2.使用临床组织样本证明细胞类型特异性EV实用性即如何参与阿尔茨海默病（AD），并进行了蛋白质共表达网络分析，生成了与不同功能和脑细胞类型相关的AD脑源性EV蛋白共表达网络。

技术手段：外泌体-LFQ蛋白质组学-TMT蛋白质组学-WGCNA分析（青莲百奥可提供)  

研究思路

 

  

结果展示

1.hiPSC衍生脑细胞分化和特性结果

作者首先利用人类诱导多能干细胞(hiPSC)分化成四种神经细胞类型：星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，并通过RT-PCR和细胞类型特异性标记物验证这四种分化细胞的有效性，并通过ELISA方法对这些分化的细胞进行了功能的表征。随后，利用非标记定量蛋白组学（LFQ）分析了四种类型细胞的蛋白表达谱，结果展示共鉴定到3206个蛋白（图1g），发现四种分化神经细胞分别对应的特异性蛋白标志物的表达量均比较高，这揭示了hiPSC向主要脑细胞类型的分化有效性。

 

 

   2.hiPSC衍生脑细胞外囊泡的分离与鉴定

作者从hiPSC分化的的四种类型的神经细胞中利用超速离心法分离胞外囊泡(EV)，通过透射电子显微镜和纳米颗粒追踪分析方法对EV进行了表征。为了比较不同细胞类型的EV蛋白质组成，利用液相色谱-串联质谱平台进行针对胞外囊泡的非标记定量蛋白组学（LFQ）实验，发现非EV蛋白在EV中未检测到，从而证明从hiPSC衍生的脑细胞中分离的EV组分质量良好，具有高纯度。为了进一步确定人类神经细胞衍生EV中普遍存在的泛EV标记候选物，比较了在不同细胞类型的EV中发现的高度代表性蛋白质，（CD9、CD63和CD81）、（PDCD6IP/ALIX）、（TSG101）、（SDCBP）（FLOT1）和（FLOT2）。此外，根据质谱结果，作者研究了在不同细胞类型的EV中发现的高度代表性蛋白质，利用所有EV样本中重复率筛选到了16个在四种分化神经细胞中均同时表达的蛋白，这些分子将有助于未来开发潜在的泛脑EV标记物。

 

3.神经细胞类型特异性EV蛋白质组的比较

作者为了进一步确定从hiPSC衍生神经细胞分离的EV蛋白质组成差异，作者利用iBAQ比较了不同细胞类型囊泡蛋白的丰度。主成分分析（PCA）和相关系数结果显示不同EV蛋白组成具有细胞类型特异性，在不同细胞类型的EV样本中表现出良好的区分性，表明EV具有良好的生物再现性和潜在的细胞类型特异性蛋白质特征。根据聚类分析结果筛选到了不同细胞类型特异性的差异表达EV蛋白（图3c）,他们参与了不同的生物过程（GO）和KEGG通路（图3d），如星形胶质细胞（astrocytes）特异的EV蛋白主要富集在与细胞外基质相关的生物学过程（包括细胞粘附、细胞外基质(ECM)受体相互作用和整合素介导的信号转导）以及生物代谢相关通路（包括糖酵解、丙酮酸代谢过程、胆固醇稳态、氨基酸的生物发生和碳代谢）。少突胶质细胞（iOligo）EV中丰富的生物过程和途径涉及铁离子稳态和溶酶体功能。总之，这些比较分析可能代表了外泌体中捕获的每种细胞类型特有的不同细胞功能。总之，这些比较分析可能代表了外泌体中捕获的每种细胞类型特有的不同细胞功能。

 

4.hiPSC衍生的细胞类型特异性EV蛋白的鉴定

鉴于在不同的hiPSC衍生的神经细胞类型中观察到EV蛋白特征，故作者进一步筛选特定的特异性蛋白作为脑源EV的细胞类型特异性生物标记物。利用细胞类型内蛋白质丰度相对于其他细胞类型的倍数变化进行初步筛选（图4a-b），得到细胞类型特异性EV蛋白质列表，显示iNeuron EV中共有30种蛋白质，iMGL EV中有70种蛋白质，iAtrocyte EV中有300种蛋白质，以及iOligo EV中的14种蛋白质。随后通过免疫印迹法从健康对照组和AD患者中分离出脑源性EV样本进行验证实验(图4c-4d)，最终确定将NCAM1, ATP1A3作为神经元EV的标志物, LRP1, ITGA6, EAAT1作为星形胶质细胞EV的标志物, LCP1作为小胶质细胞EV的标志物, LAMP2, FTH1和 MOG 作为少突胶质细胞EV标志物。整个数据提供了不同脑细胞类型中细胞类型特异性EV蛋白的直接证据，可用于开发从人类生物流体和组织中分离人类神经细胞类型特异性EV的新标记物。

 

5.人脑组织衍生EV的蛋白质组学分析

为了加强蛋白组学的研究发现以及探索其潜在的临床应用，作者对11名健康对照(HC)、8名轻度认知障碍患者(MCI)和11名AD患者的脑组织进行不连续蔗糖梯度超速离心法富集EV，随后进行了TMT标记定量蛋白组学分析（图5a），共鉴定到4286个脑源性EV蛋白（其中2645个为共有蛋白），差异比较分析筛选到242个显著改变的蛋白（图5c）。生信分析显示AD中这些上调的DEPs与细胞外基质、白细胞迁移、转运和整合素介导的信号通路有关，而下调的DEPs与DNA损伤识别、蛋白质折叠和Cullin去乙酰化相关。作者利用P值和FC筛选到了多个疾病特异性差异表达蛋白，共确定了42个DEP，AD-EV特异性变化大部分与AD密切相关，最终为区分从HC、MCI和AD大脑中分离出来的EV提供了可能（图5e）。

 

6.具有细胞类型特异性的AD-EV蛋白共表达网络的构建

应用WGCNA构建了一个使用2645种常见蛋白质的AD-EV蛋白共表达网络，帮助确定疾病相关的关键分子途径和潜在治疗靶点。结果表明从共表达的蛋白质组中鉴定了11个模块，并将模块特征蛋白与AD的神经病理学特征（临床痴呆、斑块负荷、神经纤维缠结负荷）进行关联分析，三个模块（M1、M6和M9）与所有三个AD性状均呈负相关，其中M7模块（与质膜的固有成分相关）与AD病理特征成最强的正相关 (图6b）。

作者进一步评估了脑源性EV蛋白的每个共表达模块中细胞类型标记物的富集情况，发现在M7模块显著富集星形胶质细胞EV标记物，且与AD性状显著正相关，意味着星形细胞来源的EV蛋白标志物或许可作为AD的生物标志物（图6c）。此外与HC相比，M4、M6和M7模块在MCI样本中的增加或减少趋势与AD样本中相同，这意味着细胞粘附组装、细胞对氮饥饿的反应以及质膜固有成分的变化发生在AD临床前阶段的早期。

 

7.M7/星形胶质细胞模块在激活的星形细胞来源的EV标记物中富集，并与AD病理相关

由于M7模块与AD特征和星形胶质细胞来源EV的相关性最强，因此进一步验证了M7模块是否与激活的星形胶质细胞来源的EV相关。结果显示M7模块在有活性的星形胶质细胞来源的EV中显著富集（图7a），M7模块中激活的星形胶质细胞衍生EV标记物与前10个hub蛋白密切相互作用（图7b），进一步探索这些EV蛋白在M7中的潜在生物学功能和上游通路，我们进行了通路分析，确定了与内吞作用、整合素信号和NF-B激活相关的多个重要典型途径。此外，探究了M7星形胶质细胞模块中的EV蛋白是否与AD病理相关，重点关注M7内激活的星形胶质细胞衍生EV标记物（CAV1、ICAM1和ITGA5）和hub蛋白（ITGB1），利用免疫沉淀实验分析了5名HC和5名AD患者中活性星形胶质细胞来源的EV标志物与M7模块中的中心蛋白(ITGB1)的相互作用。上述结果表明在AD发病机制中，M7星形胶质细胞模块中的EV蛋白共表达网络发挥主导作用，鉴定出的M7 EV蛋白(如ITGB1)，特别是在星形细胞特异性EV中，可作为潜在的AD生物标志物。

 

 

总结

本文研究了四种不同的人类诱导多能干细胞衍生的神经细胞分离的EV蛋白质组学特征，筛选出16个泛EV候选标记物，并最终确定了新的细胞类型特异性EV蛋白标记物，后续利用临床组织样本探索了EV蛋白共表达网络与AD性状的相关性，为未来以细胞类型特异性方式分析EV在神经退行性疾病中的功能提供了丰富的资源。

 

END