1型糖尿病（T1D）是由β细胞进行性丧失引起的，是由促炎细胞因子信号传导的过程，破坏了促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡，但其具体机制目前尚不清楚。2020年02月04日，来自美国太平洋西北实验室等研究团队在国际知名学术期刊Cell Metabolism（IF：21.567）上发表了题为“Comprehensive Proteomics Analysis of Stressed Human Islets Identifies GDF15 as a Target for Type 1 Diabetes Intervention”的研究论文。该研究通过综合蛋白质组学分析，旨在揭示细胞因子诱导的β细胞信号的分子特征，以确定调节细胞死亡和生存之间平衡的因素。研究发现了一种生长/分化因子15（GDF15，也称为巨噬细胞抑制因子1[MIC-1]）是一种胰岛保护因子，可作为T1D干预的潜在靶标。

 

1型糖尿病（T1D）是一种慢性疾病，这种疾病会缩短患者的寿命超过10年。T1D是由自身免疫介导的破坏胰岛中产生胰岛素的β细胞引起的，免疫疗法已被广泛测试以预防或治疗该疾病。近的临床试验表明，免疫调节可以推迟某些高危个体的疾病发病，但对药物治疗的反应通常是不同的，持续时间有限。这一过程中主要障碍是缺乏对胰腺β细胞在免疫激活和疾病进化过程中的反应的了解。因此，研究人员采用促炎细胞因子（IL-1β和干扰素-γ）联合处理人胰岛，并进行深入的蛋白质组学分析，并阐明了促炎症细胞因子调节GDF15合成的机制、其在阻断凋亡信号传导中的作用以及在体内预防胰腺炎的活性。

 

实验材料

 

来自10个供体的50 U/mL IL-1β和1000 U/mL干扰素-γ 处理的胰岛和对照胰岛组织

 

技术策略

TMT蛋白质组学

 

研究结果

细胞因子处理胰岛的蛋白质组学综合分析

蛋白质组学分析共得到11,324种蛋白质的定量信息，其中387个蛋白的丰度在细胞因子处理后发生了显著变化（图1C）。接下来，作者使用DAVID数据库进行了功能富集分析，发现细胞因子处理调节了与核因子-κB信号、细胞分裂素受体相互作用、细胞凋亡、抗原处理和呈递、细胞外基质、凝血和补体级联、类风湿性关节炎和癌症转录失调相关的蛋白（图1D）。蛋白质组学检测共鉴定到54种细胞因子、趋化因子和生长因子，其中19种受IL-1β+干扰素-γ调节。在这些受调控的细胞因子、趋化因子和生长因子中，16个上调，3个下调。综上所述，蛋白质组学分析显示，促炎症细胞因子处理的胰岛中与细胞因子信号转导和凋亡相关的蛋白质有显著的调节作用。

图1.干扰素-γ和IL-1β处理的人胰岛的蛋白质组分析

 

 

筛选关键靶点

为了确定可能的治疗靶点，采用以下4个标准进一步筛选蛋白：（1）对IL-1β+干扰素-γ处理具有调节作用；（2）参与细胞凋亡；（3）分类为细胞因子、趋化因子或生长因子；
（4）非标蛋白质组验证可靠性。
 基于以上标准共筛选出5个蛋白：Fractalkine、IL-1α、IL-1β、骨桥蛋白（SPP1）和生长/分化因子15（GDF15）。在这些细胞因子中，SPP1和GDF15被选作进一步研究，因为关于它们在T1D中作用的报道有限。作者通过用IL-1β+干扰素-γ处理EndoC-βH1人和小鼠MIN6β细胞系，验证了细胞因子介导的SPP1和GDF15的下调（图2B、C）。接下来，分析了GDF15和SPP1在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠胰岛中的表达，与非胰腺炎NOD小鼠相比，胰腺炎NOD小鼠的胰岛中GDF15和SPP1的丰度降低（图2D和2E）。

图2. 干扰素-γ和IL-1β对胰岛细胞因子、趋化因子和生长因子的调节

 

GDF15和SPP1在人胰岛表达中的调控机制

为了探讨其调控机制，作者比较了IL-1β+干扰素-γ处理的人胰岛中GDF15和SPP1的蛋白和转录水平。结果显示，这两种蛋白在细胞因子处理后均显著降低（图3A）。与转录调控过程一致，细胞因子处理使编码SPP1的mRNA水平显著下降（图3A）。相比之下，编码GDF15的mRNA水平通过细胞因子处理后增加了两倍，这表明该蛋白在转录后水平上受到调节。为了验证GDF15蛋白水平的下降是否由于GDF15 mRNA翻译受阻导致的，作者进行了多核糖体图谱分析实验。结果表明，在细胞因子处理过程中，GDF15 mRNA主要存在于单核糖体部分（图3C、D）。这些结果表明，促炎症细胞因子可阻断GDF15 mRNA的翻译。

图3. 细胞因子对β细胞GDF15表达的转录后调控
 

GDF15保护β细胞免受IL-1β和干扰素-γ诱导的细胞死亡

首先使用MetaCore工具对GDF15和SPP1调控的下游信号进行了网络分析。发现GDF15和SPP1都参与到调节细胞凋亡（图4A）。之后采用50 ng/mL rSPP1或100 ng/mL rGDF15处理人胰岛素分泌的EndoC-βH1细胞12-16h，然后再用干扰素-γ+IL-1β处理24 h。蛋白质印迹分析显示，干扰素-γ+IL-1β单独处理诱导了细胞凋亡（图4B-4D）。而GDF15和SPP1处理后导致细胞凋亡减少（图4B-4D）。以上结果证实了GDF15和SPP1预处理对细胞因子诱导的细胞凋亡具有保护作用（图4E）。

图4. GDF15和SPP1阻断干扰素-γ+IL-1β诱导的细胞凋亡

 

GDF15抑制NOD小鼠胰腺炎及降低糖尿病发生率

在确定GDF15保护β细胞免受干扰素-γ+IL-1β诱导的细胞凋亡后，又讨论了它是否也能在体内保护胰岛的问题。作者采用rGDF15或对照物治疗6周龄雌性NOD小鼠（n=5），每两天一次，连续两周监测小鼠体重和血糖水平，结果显示GDF15给药后体重和血糖稳定且不受GDF15给药的影响（图5A和5B）。之后取小鼠胰腺进行组织病理学分析，结果显示，与对照组相比，GDF15处理的小鼠的胰腺炎显著减少（图5C和5D）。此外，进一步探究了GDF15是否可以预防或推迟糖尿病的发生。利用6周龄的NOD小鼠（n=20）每2天服用rGDF15，持续4周，并在长达24周的时间内监测糖尿病的发展，结果发现GDF15处理后糖尿病发病率降低53%。

图5. GDF15减轻NOD小鼠胰腺炎症

 

糖尿病患者胰腺组织中GDF15水平的研究

之后，为了验证GDF15在临床水平上的可靠性，分析了糖尿病供体胰腺中GDF15的水平。免疫染色分析显示，T1D患者的胰岛中GDF15的丰度降低了约10倍，并且T2D患者和非糖尿病对照者的胰岛中GDF15丰度相似（图7A、B）。综上所述，研究表明，患有T1D的人胰岛中GDF15的丰度降低，与在促炎细胞因子处理的胰岛和患有胰腺炎的NOD小鼠的胰岛中发现的情况相似。

图6. GDF15在人胰腺中的表达

 

 

总结

该研究提供了一个独特的资源，用于鉴定受促炎症细胞因子调控的人胰岛蛋白。研究证明了在IL-1+干扰素-γ调控的β细胞中促凋亡和抗凋亡蛋白之间存在不平衡。这种不平衡包括转录后GDF15的下调，目前显示GDF15是一种抗凋亡蛋白。人类胰岛蛋白质组的进一步扩展和挖掘有可能为糖尿病的治疗指明新的途径。

 

人胰岛蛋白质组学综合分析确定GDF15为1型糖尿病干预靶点

期刊名称：Cell Metabolism

影响因子：21.567

样本选择：细胞因子处理胰岛和对照胰岛

技术策略：TMT蛋白质组学