01 基于PEA的发现阶段和AMS相关蛋白质的鉴定

在发现阶段，测量了10个AMS包括1k和4k中受试者中的1069个蛋白质，基于q值<0.05，确定了47种差异表达蛋白（DEP），其中包括40种上调蛋白和7种下调蛋白，差异蛋白可以清楚区分AMS1k和AMS4k组，通过对上调和下调蛋白进行GO功能富集分析，发现能量代谢途径，如氮代谢、戊糖磷酸途径和糖酵解/糖异生，在Cluster2中显著下调，而在Cluster1中，细胞因子-细胞因子受体相互作用和TNF信号途径显著上调 。总的来说，参与细胞因子-细胞因子受体相互作用途径的三种细胞因子，即IL6受体家族（LEPR）、IL-1受体家族（IL18R1）和TGF-β家族（GDF15及INHBC）均上调。这些发现表明，免疫和炎症反应以及能量代谢积极参与了AMS的发病机制。

02 通过多反应监测MRM进行验证

03 机器学习进行AMS分类表征
       XGBoost机器学习模型在区分AMS4k和AMS1k、nAMS4k和nAMS1k、AMS4k和nAMS4k以及AMS1k和nAMS1k方面表现出良好的性能。本研究使用了10倍交叉验证和MRM鉴定的DEPs来增强模型的稳健性和性能。
       区分AMS1k和AMS4k组的发病机制模型中，筛选出7种重要蛋白质（RET、ISLR2、MATN3、SCARA5、CA2、MYOC和S100A12），模型的曲线下面积（AUC）为0.90。值得注意的是，根据差异丰度分析，RET、MYOC、MATN3和S100A12也是候选的发病相关蛋白。
       区分nAMS1k和nAMS4k的保护模型中，筛选得出5种重要蛋白质（ISLR2、MYOC、WFIKN1、SCARA5和ADAM15），模型的AUC为0.95，这表明这些蛋白质可能参与在高海拔地区减轻无AMS个体的AMS症状。其中，ADAM15在差异丰度分析中被认定为一种重要的候选保护蛋白。因此，ADAM15可以作为预防和治疗AMS的候选靶点。
       区分AMS1k和nAMS1k的预警模型中筛选得出8种重要蛋白质（PHGDH、UBA1、RBK、GNA13、IGFBP7、FCN2、CA2、V-set和VSIG4），模型的AUC为0.91（p值=0.001）。通过差异丰度分析，PHGDH和RBK也被确定为潜在的预警生物标志物，用于评估个体在上升到高海拔之后，AMS的发生情况。尤其是参与葡萄糖/能量代谢的PHGDH，其重量是模型中其他蛋白质的四倍。
       区分AMS4k和nAMS4k的诊断模型中筛选出13种重要蛋白质（TRAF2、AGT、IL18R1、THY1、ISLR2、TCN2、CD38、GNA14、INHBC、GC、RBKS、WFIKN1和ARF6），模型的AUC为0.89，这表明这些蛋白质具有作为AMS诊断生物标志物的潜在价值。通过差异分析，TRAF2、GC和WFIKN1也被确定为候选诊断生物标志物。
        综上，此研究建立了稳健的机器学习模型，很好地区分了这些比较组，并提供了四组候选生物标志物。

04 AMS的关键临床指标
      利用差异临床指标，构建机器学习模型，以区分AMS4k与AMS1k、nAMS4k与nAMS1k、AMS4k与nAMS4k以及AMS1k与nAMS1k。在区分AMS1k和AMS4k的发病机制模型中，有19个临床指标（如如A-TPO、C-peptide、phosphate、E2、CKMB和thyroxine）分类准确率非常高（AUC=0.96，p值<0.0001）。保护模型中用16项临床指标（FT3、ferritin、free Prostate-specific antigen (FPSA)、creatinine、C3C和 FSH）区分nAMS1k和nAMS4k，AUC为0.94（p值<0.001）。预警和诊断模型分别筛选得到3个临床指标（proBNP、BILT和 thyrotropin）和4个临床指标（procalcitonin、TP1NP、C-peptide和insulin），AUC分别为0.67和0.7（p值>0.05）。临床指标在预测和诊断AMS方面的表现似乎不如蛋白质。
       在预测和诊断模型中，单独使用蛋白质和组合数据获得的分类性能相似。值得注意的是，与使用组合数据获得的预警模型相比，单独使用蛋白质获得的预警模型中保留的特征更少。此外，利用组合数据获得的诊断模型中，所有重要特征都是蛋白质。因此，在预测和诊断AMS时，蛋白质是比临床指标更好的选择。

05 AMS个体间碳水化合物代谢相关蛋白的变化
       在低海拔地区，患AMS的个体比未患AMS的个体对糖异生的利用率更高。糖异生的两个关键酶G6PC和PCK1在AMS1k组中的丰度高于nAMS1k组。在高海拔地区，患有AMS的个体可能比未患AMS的个体表现出更高的糖酵解利用率，研究发现AMS4k中的PFKM是糖酵解的关键限速酶，其水平高于nAMS4k，这将导致产生更多的1,6-二磷酸果糖，从而刺激糖酵解。其次，AMS个体乳酸脱氢酶A（LDHA）和ALDOA水平高于未患AMS个体，二者参与糖酵解和糖异生，糖异生相关酶PCK1和G6PC在AMS4k和未患AMS4k之间表现出相似的表达水平。因此，推测AMS4k组的糖酵解而非糖异生比nAMS4k组更活跃。
        在低海拔和高海拔地区，患有AMS的个体可能比未患AMS的个体具有更活跃的TCA循环。尽管在两组个体中，在上升到高海拔后都发现TCA循环受到抑制，但PDHA1在患有AMS的个体中的水平仍然高于未患AMS的个体。
       患有AMS的个体在低海拔地区可能表现出更强的糖异生能力，在高海拔地区的糖原利用率和糖酵解率可能高于未患有AMS的个体。在上升到高海拔后，所有个体的TCA循环都受到抑制，而患有AMS的个体的TCA循环比未患有AMS的个体更活跃。
        综上，不同的碳水化合物代谢途径在适应高海拔环境中起着关键作用。

06 蛋白质、临床指标和AMS症状表型之间的关联

       对53名低海拔或高海拔人群的临床指标、蛋白质和AMS症状表型之间的相关性分析表明，有助于了解AMS的致病机理、预警或诊断。未发现AMS1k和nAMS1k之间的差异特征与AMS症状表型相关。然而，在AMS1k和nAMS1k之间发现促甲状腺素与葡萄糖/能量代谢相关蛋白PCK1、PHGDH和IGFBP7之间存在联系。促甲状腺素和PLA2G7的单核苷酸多态性分别与血压变化和高血压相关。此外，在AMS4k组和nAMS4k组之间，包括FGF23、RET、IL18R1和GNA14在内的蛋白质与AMS症状表型（如食欲不佳、呼吸困难和唇发绀）呈正相关，而非临床指标。此外，C-peptide与13种蛋白质呈正相关，例如候选致病相关蛋白MYOC（ρ=0.42，q值<0.05）、KITLG（ρ=0.27，q值<0.05）和诊断生物标记物TRAF2（ρ=0.36，q值<0.05）。因此，C-peptide可能参与AMS的发病机制，而我们研究的临床指标在预测和诊断AMS方面的表现并不优于蛋白质。

总结：

       使用Olink的PEA技术分析了10名低海拔和高海拔AMS患者的1069种蛋白质，并鉴定了47种AMS相关蛋白质。使用基于MS的MRM技术，在53名有或无AMS的低海拔和高海拔个体中验证了102种蛋白质。PEA和MRM的结合可以在很大程度上避免假阳性，提高候选生物标志物的质量。系统地分析了可能参与AMS发病机制、保护、预测和诊断的蛋白质和临床指标，以确定候选治疗靶点和生物标志物。最后，分析了同一队列中的22个AMS症状表型和65个临床指标，并确定了AMS相关蛋白、表型和临床指标之间的强相关性，这为使用蛋白质和临床指标精确重新定义AMS提供了基础。