人体皮肤包括复层鳞状上皮和真的皮层，以及各种基质细胞和细胞外基质（ECM）。基底膜（BM）是真的皮层顶部的薄层，通过传递物理和生化信号来确定表皮干细胞（EpSCs）并维持皮肤组织的层次结构和功能。然而，干细胞生态位如何通过调节EpSCs的行为来维持组织稳态和控制伤口愈合尚未完全清楚。近期，由中国医学科学院北京协和医院和蛋白质科学机构（北京）等研究团队在国际学术期刊Nature Communications（IF：17.694）上联合发表了一篇题为“Spatially resolved proteomic map shows that extracellular matrix regulates epidermal growth”的研究论文。在该研究中，使用空间定量蛋白质组学（青莲百奥提供技术支持）结合脱细胞处理、激光捕获显微切割方法构建了分层皮肤蛋白质组图谱。原位分析了正常皮肤组织和皮肤病组织的不同结构的特定功能。该研究为ECM蛋白如何促进EpSCs的生长和功能提供了见解，有助于未来对于皮肤溃疡或涉及表皮细胞功能障碍和再上皮化障碍的顽固性皮肤疾病的临床治疗。
 

       皮肤作为人体一个也是大的屏障器官，具有坚韧柔韧的结构，使其能够通过快速修复机械、化学和生物损伤来适应外部条件。在哺乳动物中，皮肤包含几个不同的细胞群，分成以下基本层：表皮、真的皮和皮下（皮下脂肪）层。在这项研究中，采用脱细胞处理、激光捕获显微切割（LCM）和质谱（MS）相结合的方法，构建了包含角质层（SC）、颗粒棘层（granular-spinous，GS）、基底层（BL）、基底膜（BM）、真的皮浅层（SD）和皮深层（DD）六个皮肤层的蛋白质空间分布的人体皮肤分层发育谱系蛋白质组图谱。
 

 

研究结果

人体皮肤分层的空间蛋白质组结构

        样本来自六个皮肤层（SC、GS、BL、BM、SD和DD），使用LCM结合作者自建的脱细胞方法，根据分层结构对皮肤功能进行深入研究。结果共鉴定到4896个蛋白质，包括SC中的4686个、GS中的4676个、BL中的4556个、BM中的3775个、SD中的4677个和DD中的4443个（图1d）。对各层皮肤中的蛋白质进行相关性分析，发现六层皮肤的蛋白质组可分为以下皮肤部分：包括SC、GS和BL的表皮部分；BM部分；以及由SD和DD组成的非BM皮部分（图1e）。细胞成分分析显示，表皮、BM和皮切片之间存在显著差异（图1f，1g）。

人体皮肤分层的空间功能特征

       为了确定划分不同关键特征的边界及其生物学意义，进行了层次聚类分析（HCA）和基因本体论（GO）分析，确定了六个蛋白质模块，表征具有不同功能的皮肤层（图2a）。模块1代表六层中SC中含量高的蛋白，它们参与衰老的各个方面，如角质化、角化、脂质代谢、蛋白水解和程序性细胞坏死。模块2和3分别代表在成熟（GS）和增殖（BL）表皮中高度表达的蛋白。GS中富集的蛋白具有与SC相似的功能，例如衰老和防御细菌。BL中富集的蛋白质参与了表皮细胞分化（如毛囊成熟）和增殖（如毛发周期阶段）的生物学过程，表明BL主要负责表皮细胞的发育。与BL相连的BM是BL的EpSCs重要的生态位。BM中富集的蛋白主要参与防御反应，包括内皮屏障的建立和对细菌的反应，维持细胞性以及黑质的发育。

       对不同深度真的皮的蛋白质组分析表明，富含在真的皮中的蛋白质参与内吞和胞吐、免疫反应和凝血等过程。ECM蛋白位于细胞外，在调节皮弹性、保水、衰老和伤口愈合方面发挥着重要作用。结合Matrisome数据库，进一步分析真的皮各层的ECM成分。构建了分层人体皮ECM图谱，包括在BM（277种）、脱细胞SD（280种）和脱细胞DD（284种）中鉴定的ECM蛋白。

二期梅毒患者的表皮功能障碍

       梅毒是一种由Treponema pallidum引起的疾病。初期特征为皮肤损伤，会损害大脑、神经、眼睛或心脏。为了确定T. pallidum对二期梅毒（SSP）患者中不同表皮区域功能的影响，对GS(SSP-GS)、BL(SSP-BL)和SD(SSP-SD)组的皮肤组织进行了蛋白质组学分析（图3b）。在SSP和对照样本中，GS、BL和SD分别鉴定出4258、4268和4120个蛋白。对BL中差异表达的蛋白进行了HCA和GO分析（图3C）。与对照组相比，SSP组中性粒细胞聚集、先天免疫反应、趋化因子产生、白细胞迁移和自噬等免疫相关过程上调，提示SSP皮肤组织中的EpSCs存在对免疫细胞的炎症反应。与对照组相比，SSP组与细胞周期和形态发生过程、ECM组织、细胞-细胞黏附和半桥粒组装相关的蛋白表达下调（图3C），表明BL发生了表皮细胞功能障碍。此外，SSP中典型的Wnt信号通路下调，这表明皮肤中表皮细胞的功能障碍可能是由Wnt信号通路介导的，该信号通路参与了皮肤动态平衡和创面愈合过程中EpSC的发育。
 



BM的TGFBI促进EpSC的增殖
       为了研究BM中对EpSC功能调节起重要作用的ECM蛋白，分析了与BM和BL接触的BM组分和半桥粒复合物。在这些蛋白中，转化生长因子-β诱导蛋白ig-h3（TGFBI）在SSP的BL和SD中的表达都下调。接下来，将TGFBI重组蛋白添加到人EpSCs的培养基中。转录组学分析表明，与对照样品相比，TGFBI处理的样品中增殖标志物（PCNA和Ki67）和 EpSC 标志物（P63和KRT14）的表达增加（图4d，e）。而在TGFBI处理后，细胞分化相关通路（例如Notch信号通路中NOTCH1和LAMA5）和EpSCs成熟标志物（KRT10）的表达降低（图4c，f）。总之，这些结果表明，TGFBI作为皮肤中EpSCs必不可少的生态位，可以促进EpSCs的增殖，并通过Wnt/β-Catenin途径维持其干性和细胞连接。
 



TGFBI促进SSP-EpSCs增殖

       为了确定TGFBI能否恢复SSP-EpSCs的功能，作者分离SSP-EpSCs并培养10天（图5a）。与对照组相比，SSP-EpSCs的干性、增殖和细胞-细胞连接受损程度降低（图5b，c）。TGFBI可以挽救SSP-EpSCs的分化过程并促进其增殖，使EpSCs中KRT14和PCNA的表达水平恢复正常（图5b，c）。与对照组相比，SSP组细胞凋亡、免疫应答和微生物侵袭等生物学过程上调。然而，在TGFBI治疗后，这些过程恢复到正常水平（图5e）。此外，SSP组下调蛋白参与的生物学过程主要包括线粒体组织和翻译、蛋白质定位和翻译后修饰、DNA损伤修复和细胞周期。许多与细胞周期、表皮发育和神经系统发育相关的蛋白质在SSP组中表达下调，但在TGFBI治疗后表达水平恢复（图5f）。综上所述，TGFBI可增强SSP-EpSC的增殖、上皮化和表皮发育等功能，有望成为治疗皮肤损伤的潜在靶点。

总结

      蛋白质的空间表达对于确定蛋白质在组织中的准确定位和功能至关重要。该研究采用空间蛋白质组学技术构建了分层皮肤蛋白质组图谱。数据分析表明，ECM在基质微环境中对表皮细胞的生长起着重要的调节作用。BM ECM是EpSC生态位的重要组成部分，对EpSCs的功能起着重要的调节作用。在BM中，TGFBI是一种ECM糖蛋白，可促进EpSCs 的增殖并促进创面愈合。值得注意的是，TGFBI显示出对于难治疗性伤口患者的治疗潜力，并可能有益于临床实践。