食管癌在全球发病率排名第七，死亡率排名第六，5年生存率为20%。大约50%的病例发生在东亚和中亚，特别是在我国，食管鳞状细胞癌(ESCC)是主要的组织学类型。化疗和放疗仍然是标准的治疗方法，然而，目前还没有有效的生物标志物或分子分类方案来为ESCC患者量身定制治疗方案。 2022年12月29日，中国医学科学院肿瘤医院刘芝华/焦宇辰团队、深圳湾实验室詹启敏/崔永萍团队合作，在Cancer Cell（影响因子：38.585）上发表了文章Integrated Multi-omics Profiling Yields a Clinically-Relevant Molecular Classification for Esophageal Squamous Cell Carcinoma，通过多组学（全基因组、表观基因组、转录组和蛋白质组）特征描述了食管鳞状细胞癌图谱，并整合数据将食管鳞癌分为四种分子亚型：细胞周期通路激活型（CCA）、NRF2通路激活型（NRFA）、免疫抑制型（IS）和免疫调节型（IM），每个亚型都具有潜在的治疗靶点/可用于诊断的生物标志物，为患者实现精准医疗提供了基础数据和思路。  研究亮点 1、队列数据建立关于ESCC多组学、多层次分子表达图谱概况；2、多组学数据结合聚类分析将ESCC分为四种分子亚型；3、分析每种ESCC亚型特征以及潜在靶点；4、机器学习挑选特定分子特征的分类体系通过识别IM亚型来预测ICB疗法的响应性；      结果展示一、基于多组学数据的ESCC分型
为了深入地探索ESCC的分子特征，作者对155例ESCC患者的癌和癌旁组织进行了全基因组测序（WGS）、全基因组甲基化测序（WGBS）、RNA测序（RNA-seq）和小RNA测序（sRNA-seq）以及蛋白质组学（73例）。利用这些数据，对155例病例进行了一致性聚类和聚类分配的再聚类（COCA）分析，产生了四个亚型（图1A），它们与临床TNM分期、淋巴转移和免疫评分显著相关（图1B和1C）。四种亚型分别为：（1）以CCND1和CDKN2A/B的CNAs为特征的细胞周期信号激活(CCA)亚型(25.2%，n = 39)（图1A、1D）；（2）NFE2L2和SOX2基因上调的NRF2致癌激活（NRFA）亚型（24.5%，n=38）（图1A、1E）；（3）免疫抑制（IS）（19.3%，n=30）亚型，具有更高水平的浸润B细胞和NK CD56bright细胞，以及更高的ERBB2蛋白水平；（4）免疫调节（IM）亚型（31.0%，n=48），其成纤维细胞、CD8+T细胞、先天免疫细胞浸润较高以及免疫评分较高（图1C）。
   图1四种COCA亚型的特征（A-COCA亚型分组的关键分子和临床特征；B-TNM分期和淋巴转移的比例；C-基于COCA亚型的免疫评分；D-CCA和非CCA亚型中CNAs特征比例饼图。（E）NRFA和非NRFA亚型中，NRF2通路基因变化情况饼图。 二、CCA亚型与激活的细胞周期信号有关
CCA亚型的特征为复发性CNA，分子特征体现在11q13.3/CCND1扩增（74.4% vs 23.3%，CCA亚型 vs 非CCA亚型）和CDKN2A/B同源缺失（59.0% vs 37.9%，CCA亚型 vs 非CCA亚型）（图1D、2A）。11q13.3中受影响的基因组区域含有致癌基因CCND1、CTTN等，这些基因在CCA病例肿瘤组织中的表达水平显著增高（图2B）。CCA样品中CDKN2A/B的表达水平显著降低（图2B），CDKN2A/B也通过突变和启动子区的高甲基化途径失活。总之，84.6%的CCA病例具有与细胞周期失调直接相关的基因变化（图1D）。
为检测CCA亚型患者能否从CDK4/6抑制剂（palbociclib）治疗中获益，研究者构建了3类食管鳞癌类器官模型（PDOs）：CDKN2A缺失（PDO4）、CDKN2A缺失/CCND1扩增（PDO7）、CDKN2A/ CCND1两个基因野生型类器官（PDO2）。观察细胞生长研究者利用PDO半数抑制浓度（IC50）值来评估palbociclib药物敏感性，发现palbociclib在PDO2中的IC50（41.33μM）显著高于PDO4和PDO7（IC50分别是13.58μM和2.03μM），表明有细胞周期改变的食管鳞癌患者对palbociclib更加敏感（图2F）。因此，推测部分CCA亚型患者可从CDK4/6抑制剂的治疗中获益。
 
图2 CCA亚型与细胞周期信号传导的激活相关（A-CCA和非CCA病例之间细胞周期通路中的基因组变化；B-COCA亚型肿瘤和非肿瘤组织中11q13.3基因表达水平的比较；C-CCA和非CCA亚型细胞周期中基因的突变频率；单抗治疗下患者衍生类器官（PDO）的明视野图像（D）和细胞活力（E）；F-PDO中palbociclib单抗的IC50值。
  三、NRFA亚型中NRF2和SOX2信号被激活
NRFA亚型的特点是NRF2通路中的基因突变（NFE2L2扩增、NFE2L2突变、KEAP1/CUL3突变）（图1E和3A）。分析ESCC亚型中NRF2通路的基因的表达情况，发现在NRFA样本中，NFE2L2的表达水平显著高于其他三种亚型（图3B）。此外，NRFA亚型中KEAP1的蛋白质水平降低（图1A）和SOX2基因高表达（图3A和3B）。多组学分析NFE2L2和转录因子SOX2的mRNA表达水平呈正相关（图3C），确定了NRFA亚型中的全新机制，即NRF2通路因SOX2的转录上调而被激活。
对ESCC肿瘤细胞ZEC145和ZEC166进行了ChIP分析。结果显示SOX2与NFE2L2的启动子区的特定区域结合（图3D）。此外，敲低SOX2显著降低了NRF2和NQO1的mRNA和蛋白质水平（图3F和3G）。这些数据证明了ESCC中SOX2介导的NRF2调节，并突出了SOX2表达可作为NRFA亚型的候选标志物。对ESCC组织进行NRF2免疫组化染色（IHC）分析，结果显示NRFA病例中NRF2的蛋白质水平显著升高（图3H），且NRFA亚型中NRF2通路基因的变异和SOX2扩增的患者NRF2蛋白表达水平高（图3I/J）,更多的患者可能从靶向NRF2的治疗中获益。
图3NRFA肿瘤亚型中的多组学变化（A-NRFA和非NRFA肿瘤中NRF2通路基因和SOX2的基因组学变化；B-四种COCA亚型中NFE2L2、KEAP1、CUL3和SOX2的基因组变化和基因表达水平差异；C-NFE2L2和SOX2表达水平之间的关联性；D-通过染色质免疫沉淀法（ChIP）；E-SOX2在NFE2L2启动子区中的结合；ESCC细胞ZEC145（F）和ZEC166（G）中SOX2、NFE2L2和NQO1的mRNA和蛋白质表达水平；H-四种COCA亚型标本中NRF2的免疫组化（IHC）染色（n=74）；I和J-NRFA亚型中NRF2的IHC染色。 四、CCA和NRFA亚型富含CpG甲基化岛表型通过WGBS数据分析发现肿瘤样本中的CpG岛（CGI）区域整体上甲基化程度较低（图4A）。差异甲基化区域（DMR）的分析发现高DMR甲基化富集在启动子区（尤其是启动子CGI区），而大多数低甲基化DMR分布在基因间、增强子和基因体区（图4B）。因此，专注于高甲基化启动子CGI位点，并通过208个位点定义了食管CpG甲基化岛的表型（E-CIMP），这些位点在超过50%的ESCC样本中显示出高甲基化（图4C）。在所有病例中，E-CIMP+在CCA和NRFA亚型中富集程度高（图4E）。
 
 图4 CCA和NRFA亚型中DNA甲基化改变及其相关性（A-全基因组甲基化水平和DMR区域；B-低甲基化DMR（左图）和高甲基化DMR（右图）分布情况；C-基于208个CIMP甲基化位点的甲基化水平；D-通过ESCC标志物定义的CIMP组和TNM分期或淋巴转移的比例；E E-CIMP+和E-CIMP-亚型中CCA+NRFA和IS+IM病例的分布。 五、IS和IM亚型具有不同的免疫细胞浸润情况为了系统地描述四种ESCC亚型之间肿瘤微环境（TME）的差异，分析了主要肿瘤浸润免疫细胞和基质细胞群的分布情况，发现IS和IM亚型均显示出高水平的浸润免疫细胞，这与IS和IM亚型的高免疫评分相一致（图5A）。免疫细胞的浸润通过组织微阵列（TMA）中的多标记免疫荧光（MIF）进行验证。结果证明，IS亚型富含B细胞和NK CD56bright细胞，而IM亚型富含CD8+T细胞和巨噬细胞（图5B和5C）。抗PD-1治疗在ESCC患者中产生了异质性反应，因此应用一种算法（图5D）探讨了IS和IM病例的免疫学相关特征。发现IM中的主要免疫细胞组成（名为“CD8+T巨噬细胞”）；而IS中的主要模块（名为“CD4+Tcm-Tem”）（图5D）。
 
图5 ESCC中的肿瘤浸润性免疫细胞（A-热图显示了四个COCA亚群中肿瘤浸润免疫细胞的标准化富集分数（NES）；B-四种COCA亚型样品的多标记免疫荧光（MIF）；C-基于MIF分析的四种COCA亚型样本中免疫细胞的比率；D-IS（上）和IM（下）病例的TME图。
  六 IM分类预测免疫治疗反应
为了探讨基于多组学的分子分类与免疫检查点阻断（ICB）反应之间的关系，通过一项抗PD-1抗体（SHR-1210）单药治疗的I期临床试验（NCT02742935），收集43名ESCC患者的样本及临床信息，患者的治疗反应被评估为部分反应（PR）、进展性疾病（PD）或稳定疾病（SD）。对治疗前收集的肿瘤组织样本进行多组学分析（mRNA表达数据、外显子组测序数据和DNA甲基化数据)。结果表明，PR患者聚集在IM亚型，而PD患者聚集在CCA/NRFA/IS亚型（图6A）。由于IM患者对PD-1抗体更敏感，基于155例ESCC病人的多组学数据，开发了一种分类方案，以识别ESCC IM亚型的病例特征。终模型包含28个多组学特征，并在验证数据集（n=61）中获得了良好性能（图6C和6D）。此外，在17名接受PD-1治疗的患者获得了所有28个组学特征的高质量数据并应用了该IM分类方案（图6B），识别出7例PR病例中的6例为IM，10例PD或SD病例中的9例为非IM，特征模型在预测免疫治疗的响应性方面，显示出85.7%的敏感性和90%的特异性，（图6G）。之后，利用公共数据库从TCGA ESCC81例患者中识别出17名IM患者。这些结果表明，IM分类法方法可筛选抗PD-1治疗的获益者并预测其免疫治疗疗效，有非常重要的临床价值。
 
图6 IM亚型分类预测免疫治疗的反应（A-基于COCA亚型之间差异表达基因的树状图；B-多组学IM分类模型示意图；C-受试者操作特征（ROC）曲线；D-分类特征表达热图；E-分类的特征重要性条形图；F-抗PD-1临床试验中预测为IM组和非IM组患者的Kaplan-Meier生存曲线；G-IM分类对PD-1响应者的ROC曲线。  总结本研究基于大队列生物样本的多层次数据（全基因组、表观基因组、转录组和蛋白质组）全面整合分析，将食管鳞癌ESCC分为CCA、NRFA、IS和IM四个分子亚型，在ESCC的每个亚型中，发现了潜在的治疗靶点和诊断标志物，这为未来ESCC的精准治疗提供了坚实的基础。