众所周知，微波会产生热效应和非热效应，微波消融可产生热效应激活机体免疫系统，并已广泛应用于癌症治疗，然而，微波对免疫系统的非热效应在很大程度上仍未得到探索。因此揭示多频微波对免疫系统的生物学效应至关重要。2022年11月，军事医学研究院辐射医学研究所姚传福老师在《Cells》上发表了一篇题为“The Biological Effects of Compound Microwave Exposure with 2.8 GHz and 9.3 GHz on Immune System: Transcriptomic and Proteomic Analysis.”的研究文章。该研究通过检测大鼠血液和脾脏转录组与蛋白组，揭示了多频微波对免疫系统的生物学效应，为探索其潜在机制提供了重要线索。
标题：The Biological Effects of Compound Microwave Exposure with 2.8 GHz and 9.3 GHz on Immune System: Transcriptomic and Proteomic Analysis.

期刊：Cells（IF =7.666）

时间：2022.11

背景
微波可引起多器官症状，不同频率、功率和持续时间的微波在神经系统中的生物学效应已得到广泛研究。此外，在体内和体外也证明了其影响的几种潜在机制。例如，2.8 GHz的微波照射可引起miR-30a-5p/AMPKα2信号通路诱导发生神经元自噬。免疫系统在保护人类免受内部突变和外部刺激方面起着关键作用。然而，微波诱导的免疫系统的生物效应在很大程度上仍未得到探索。


研究思路
在本研究中，研究者将大鼠暴露在日常生活中广泛使用的平均功率密度为 10 mW/cm2 的 2.8 GHz 和 9.3 GHz 多频微波中，为研究其对免疫系统的生物学效应及潜在生物机制，文章使用以下实验策略：（蛋白组和转录组由北京青莲百奥生物科技有限公司提供）。1、检测微波暴露对免疫器官引起的累积病理损伤；2、探查了多频微波对外周血的免疫影响情况以及外周血中特定细胞因子表达情况；3、转录组分析揭示多频微波在mRNA水平上的调控表达并进行PCR验证；4、蛋白组分析揭示多频微波调控的相关蛋白并进行PRM验证；


研究内容
1、2.8 和 9.3 GHz 微波对免疫器官引起的累积病理损伤

作者将大鼠随机分为4组：Sham组、2.8GHz单频微波暴露组（S10）、9.3GHz单频波暴露组（X10）和2.8GHz加9.3GHz多频微波暴露（XS10）。S10和X10组的大鼠暴露于平均功率密度为10mW/cm2的2.8GHz和9.3GHz脉冲微波6分钟。XS10组的大鼠依次暴露于2.8GHz微波和9.3GHz微波各6分钟。

在微波处理后的指定时间点，检测免疫器官的病理改变。首先6 h至28 d骨髓未观察到明显变化；胸腺和脾脏在6h时未检测到明显变化，但在单频微波和多频微波处理后7d和14d后出现严重损伤情况，如淋巴细胞的充血和核碎裂。然而，胸腺和脾脏的结构在28 d几乎恢复正常，推测可能存在自我恢复机制。由于两组织在第7d产生损伤情况严重，所以进一步分析了微波处理后7d时的脾脏超微结构，Sham组细胞结构完整，染色质排列有序，线粒体分布均匀，嵴横向和纵向排列；单频微波处理的脾脏中只能检测到轻微的改变；结果显示，暴露于多频微波会导致淋巴细胞核染色质凝结和细胞质细胞器凝固，即暴露于2.8 GHz和9.3 GHz的多频微波会对胸腺和脾脏的结构产生累积性损伤。
 2、多频微波扰乱外周血的免疫平衡

免疫稳态对于保护身体免受病毒感染和细胞突变十分重要。在这项研究中，作者分析了微波照射后的外周血中的白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。多频微波（非单频微波）在辐射后7d白细胞和淋巴细胞显著增加；28d白细胞和淋巴细胞数量恢复到正常水平，表明免疫平衡被微波短暂调节以维持免疫稳态。

接下来检查了外周血中淋巴细胞的亚型，包括T细胞和B细胞。微波暴露组中B淋巴细胞比例在处理后6 h和7 d增加，XS10组检测到更显著的升高，表明多频微波处理可以促进B淋巴细胞的增殖。如同预期，微波处理后T淋巴细胞的比例降低。XS10组与Sham组之间以及X10组与Sham组在暴露后7 d间差异显著。B淋巴细胞和T淋巴细胞的比例在暴露后28 d恢复到正常水平，与外周免疫细胞的改变一致。采用流式细胞术分析CD4 T淋巴细胞与CD8 T淋巴细胞的比例，结果发现，暴露后4 d，X8组和XS10组CD10/CD7 T细胞比例明显下调，28 d恢复正常，推测T淋巴细胞平衡受到调节。
 
3、多频微波处理调控B淋巴细胞增殖和相关细胞因子的表达
细胞因子分泌是调节免疫功能的重要机制。作者分析了几种与外周血中B淋巴细胞和T淋巴细胞增殖、成熟、活化有关的细胞因子。数据显示，X10和XS10组IL-4α、IL-6β和IL-10浓度在10 h显著升高，但IL-1α和IL-4在处理后7 d迅速恢复到正常水平。这些细胞因子与B淋巴细胞的增殖、成熟和活化密切相关，推测这可能与大鼠微波处理后7d B淋巴细胞比例升高有关。2.8 GHz微波处理后6hIL-12和IFN-γ的表达显著降低，而9.3 GHz微波辐照对TNF-α和IL-12的表达均有明显上调。虽然多频微波也下调了IFN-γ，但调控效果较弱。这些数据表明，T淋巴细胞相关的细胞因子受到2.8 GHz和9.3 GHz微波的差异调节。
4、多频微波处理改变了外周血中的 mRNA 和蛋白质表达

多频微波处理后在7 d时间点可对免疫器官造成明显的结构性损伤，并改变免疫细胞的数量，成分和功能。为了研究潜在的机制，对暴露后7 d的外周血样本进行转录组和蛋白组学分析。

转录组学结果表明，微波照射诱导了许多差异基因表达。与Sham组相比，S10组检测到114个上调基因和32个下调基因。在X10组中发现了更多的差异表达基因（DEGs），（373个上调基因和254个下调基因）。与S10和X10微波相比，多频微波诱导的DEGs多，包括548个上调基因和311个下调基因。结果显示：累积效应可能由多频微波引起。

选取与免疫调控密切相关的DEGs进行功能验证。通过qRT-PCR分析直接参与免疫应答的DEGs（如Il17ra，Pglyrp1，WAS和Atic）以及间接调节免疫应答的蛋白质结合和蛋白质转运相关DEGs（如Sept1，Mal，Ahcy和Nxf1）。数据显示，这些DEG的表达改变与转录组学的结果一致。GO分析表明，DEGs与细胞代谢和免疫调节密切相关，DEGs富集在免疫系统过程、对刺激的反应、生物调节、细胞过程和代谢过程等生物过程中；KEGG分析表明，DEGs富集在几种免疫相关信号通路中，例如免疫相关信号通路，包括B细胞受体信号通路，内吞作用，Toll样受体信号通路，抗原加工和呈递，人T细胞白血病病毒1型感染，IL-17信号通路，Th17细胞分化，白细胞跨内皮迁移和原发性免疫缺陷。

蛋白组学分析方面与mRNA表达相比，微波暴露组和Sham组之间的差异表达蛋白（DEPs）要低得多。在S10组中，20个蛋白质上调，69个蛋白质下调，而X10组发现80个上调蛋白质和10个下调蛋白质。此外，多频微波诱导的DEPs多于单频微波，包括25种上调蛋白和99种下调蛋白。四个DEPs，Camk1，Cast，Napsa和Stk26被选中进行验证。PRM质谱验证结果与蛋白质组学结果一致。

与转录组学分析的结果类似，GO分析结果表明，许多DEPs富集在免疫相关的生物过程之中，包括免疫应答，补体激活，趋化因子介导的信号通路，B细胞受体信号通路，B细胞活化的正向调节，免疫球蛋白的产生；KEGG分析表明，许多DEPs是位于免疫相关信号通路中的关键蛋白，例如自噬，内吞作用，内质网中的蛋白质加工，钙信号通路，FcεRI信号通路，蛋白质输出，线粒体自噬。结合转录组学和蛋白质组学分析，推测多频微波可以通过调节许多免疫相关基因的mRNA和蛋白质表达来调节外周的免疫平衡。
5、多频微波处理影响脾脏中的 mRNA 和蛋白质表达

脾脏作为大的外周免疫器官，在细胞和体液免疫中起着关键作用。与外周血的发现不同，XS10组脾脏中的DEGs相对于S10和X10组仅略有变化。数据表明，脾脏对S10组的微波环境比外周血更敏感。采用qRT-PCR验证了Kiaa0408L、Dnaja1、Zbtb16和Sowahb等多个DEGs的表达，结果与转录组学分析结果一致。此外，还检测到几种与免疫反应相关的基因，如Serpine1，Mal，Ahcy和Nxf1。GO分析表明，DEGs主要富集在与免疫活性密切相关的生物过程中，如免疫系统反应、细胞对刺激的反应细胞过程、细胞成分生物过程、多细胞生物过程；KEGG分析表明，DEGs参与了几种免疫相关的信号通路，包括TGF-β信号通路、人巨细胞病毒感染、人瘤病毒感染、抗原加工和呈递以及Hippo信号通路。这些数据表明，微波暴露可以改变mRNA表达谱，影响脾脏的免疫稳态。

蛋白质组学结果中X10单频微波处理组中诱导的DEPs多。然后，采用PRM验证Timm8b、Cbr3、Fth1和Napsa等多个DEPs，结果与蛋白质组学分析结果一致。以上结果进一步表明，由于微波对直接免疫相关信号通路的调控较弱，微波可能通过调节微波暴露后细胞代谢相关蛋白来影响脾脏的免疫过程。GO分析结果表明，DEPs富集于代谢和免疫相关生物过程中，如葡萄糖代谢过程、B细胞凋亡过程负调控和T细胞能量负调控。此外，X10组中的DEPs参与了许多免疫相关的生物学过程，如补体活化、白细胞介素-10生物合成过程的正向调控、循环免疫球蛋白介导的体液免疫应答、凝血酶活化受体信号通路的负调控、白细胞介素-13生物合成过程的正向调控、对肿瘤细胞免疫应答的正向调控、白细胞介素-4生物合成过程的正向调控和 参与免疫反应的自然杀伤细胞分化的负调节。KEGG分析表明，DEPs主要参与代谢和免疫相关信号通路，如谷氨酸能突触、甘油磷脂代谢、胆固醇代谢和半胱氨酸和蛋氨酸代谢、TGF-β信号通路和Toll样受体信号通路。这些数据表明，微波可能通过直接影响免疫相关蛋白和通过影响细胞代谢间接调节免疫细胞来调节脾脏中的免疫功能。
总结
2.8 GHz和9.3 GHz的多频微波处理后7d对胸腺和脾脏均造成明显损伤，处理后28 d恢复。多频微波处理使外周血中的免疫细胞增多，特别是B淋巴细胞，这可能归因于细胞因子升高，以及许多免疫相关基因的上调，如Cxcr5，Blnk和Pik3cd。此外，外周血和脾脏的转录组学和蛋白质组学分析表明，DNA复制，细胞代谢和信号转导的改变可能与微波诱导的免疫激活有关。