双盐被广泛用于治疗骨质疏松症、癌症中的骨转移瘤和其他一些骨骼疾病中，但在治疗过程中会对骨骼吸收产生抑制效果，终引发双盐相关性颌骨骨坏死(bisphosphonate related osteonecrosis of the jaw,BRONJ)。作为口腔科常见的术后疾病之一，常规拔牙等牙科手术明显增加了BRONJ的发病率。其主要发病原因是由于注射双盐降低了诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)活性，限制了内源性NO的产生，影响了NO对破骨细胞的分化和活化。 2023年2月21日，由首都医科大学口腔医学院口腔健康北京实验室和首都医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室等合作完成，发表在Cell Proliferation上的题为“Dietary nitrate improves jaw bone remodelling in zoledronate-treated mice”的研究论文（IF：8.755）。该研究通过建立BRONJ模型，研究膳食硝酸盐对唑来盐处理后小鼠颌骨重塑的影响，并结合血液中单核细胞的非靶向代谢组学分析（青莲百奥提供技术支持）及单核细胞活力测定，探究供给膳食硝酸盐对小鼠BRONJ样病变的影响。    (1)对照组，只拔除小鼠右侧上颌一磨牙;
(2) Z组，注射唑来钠并拔牙;
(3) Z + Nit组，注射唑来钠和4 mM。  1.膳食硝酸盐可改善唑来钠给药后小鼠拔牙槽骨创面愈合
通过建立BRONJ模型，如图1A所示。试验结果发现，在饮用水中添加4 mM的硝酸盐显著增加了血浆(图1B)和牙槽周围组织(图1C)中的NOx含量。MicroCT分析和组织病理学染色(图1D-F)显示，拔牙后5周，Z + Nit组的骨愈合明显优于Z组。
拔牙后结束给药(图2A)。Z组出现牙槽延迟愈合，上皮覆盖不完全等现象。而Z +Nit组和对照组愈合率更好（图2B, C)。对上颌骨玻片进行HE染色和三色染色后，与Z组相比，Z+Nit组坏死骨(%)和空腔隙区膳食硝酸盐含量显著降低(图2D, F)，骨臼蓝染区域显著增加(图2G, H)。TRAP染色显示，膳食硝酸盐恢复了唑来盐诱导的骨臼骨表面破骨细胞的减少(图2I, J)。ELISA实验检测到Z + Nit组骨臼周围组织中CTX-1和traphospylated 5b水平显著升高(图2K)。膳食硝酸盐调节了成骨和破骨细胞的动态平衡。
2. 膳食硝酸盐可调节拔牙后牙槽及周围组织的免疫微环境
如图3A, C所示，与对照组相比，注射唑来钠增加了Z组外周血成熟单核细胞出现频率。相比之下，Z + Nit组单核细胞出现频率降低。然而两组间牙槽内及周围组织中单核细胞的出现频率无显著性差异(图3B,D)。与Z组相比，Z + Nit组组显著提高了单核巨噬细胞的存活率和分化率(图3E-H)。此外，膳食硝酸盐可有效降低牙槽内和周围组织中TNF-α、IL-17A和IL-6水平，并提高被唑来钠降低的IL-10、IFN-γ和IL-27水平(图3I)。在拔牙早期，膳食硝酸盐可以保护单核细胞并调节拔牙后牙槽的免疫微环境。
3. 膳食硝酸盐诱导的单核细胞代谢组学
在饮用水中添加4 mM的硝酸盐可以显著增加血浆中NO的含量(图4A)。结合非靶向代谢组学，PCA评分图显示对照组、Z组和Z + Nit组存在明显分离(图4C)。与Z组相比，Z + Nit组有889种代谢物发生了显著变化，208种代谢物表达水平上调，681种表达水平下调(图4D)。通过人类代谢组数据库(Human Metabolome Database)进行分类，发现Z + Nit组与Z组相比，显著差异的代谢物主要为脂质和类脂分子(图4E)。进行LIPIDMAPS分类注释，以揭示相关的脂质分类(图4F)。KEGG富集分析结果显示，Z + Nit 和 Z组显著富集的途径是necroptosis途径。这些途径和代谢调节共同作用改变单核细胞功能，从而改变周围的免疫环境(图4G)。
4.NO处理对唑来钠诱导的单核细胞具有保护作用
从C57/B6小鼠中分离单核细胞，并用10 μM唑来钠处理，并添加SNP（NO供体，在培养中提供外源性NO）和CP（NO清除剂，用来阻断单核细胞中的NO），如图5A所示。唑来钠刺激24 h后，NO水平显著降低 (图5B, C)。通过MTT法和流式细胞术定量，证实了NO对单核细胞的保护作用(图5C-F)。然而，CP给药可以逆转SNP对单核细胞的保护作用。添加唑来钠后，单核细胞iNOS活性明显降低(图5G)。作者进一步研究了唑来钠诱导小鼠单核细胞毒性的分子机制和一氧化氮的保护作用。发现RIPK3的磷酸化水平显著上调，相关的下游信号效应物MLKL的磷酸化也显著上调(图5H)。这些结果表明，唑来钠刺激后24 h，凋亡通路被激活。此外，NO预处理可以降低坏死中毒效应物的水平，包括RIPK3磷酸化和MLKL磷酸化，抑制单核细胞坏死。而用CP阻断单核细胞NO可抑制SNP引起的改变。NO处理通过抑制RIPK3磷酸化来调节下游代谢，终减轻唑来钠诱导的单核细胞坏死。  
总结
该研究揭示了免疫反应代谢组学特征的一种新的调节机制。膳食硝酸盐可以通过在体内产生NO来调节唑来钠刺激的单核细胞，从而调节机体免疫，促进损伤后骨重塑。该研究有助于了解唑来钠的免疫发病机制，并提供了膳食硝酸盐在临床预防BRONJ的可行性。