蛋白质的结构与其功能状态紧密相连。蛋白的结构变化，如翻译后修饰、相互作用分子结合、寡聚化、聚集和切割，可以调节蛋白质活性。现有的生物物理方法可用于探测蛋白质结构变化，但不适用于生物的整个蛋白质组研究。青莲百奥推出无需化学修饰的对复杂生物样品中蛋白质结构变化进行全蛋白质组评估的解决方案——限制性酶解-质谱分析技术(Limited proteolysis mass spectrometry, LiP-MS)，助力于蛋白质的相互作用研究（特别是药物靶点发现）及蛋白的功能状态解析。本期，小编将系统地给大家介绍一下LiP-MS技术。
 

蛋白质结构与功能紧密相关

蛋白质的结构密切反映了其功能状态，因为结构整合了调节蛋白质活性的多层信息。生物过程受分子间相互作用和化学修饰的调节，这些相互作用和修饰可能不会影响蛋白质丰度水平，从而逃脱了经典蛋白质组学筛选的检测。例如酵母短时间内的应激反应通常与蛋白表达量无关，因此不太适合蛋白质丰度筛选。

 

LiP-MS无需化学修饰且同时提供结构变化和丰度变化的信息

化学蛋白质组学是注释蛋白质功能和发现生物活性配体靶标的重要工具，例如基于活性的蛋白质分析（activity-based protein profiling，ABPP），但需要对待研究的小分子进行化学修饰，常常引发修饰后小分子集团过大及活性降低等问题，不利于后续的数据分析及结果验证。许多生物物理方法可用于探测蛋白质结构变化，例如NMR质谱和X射线晶体学等，但这些方法不适用于生物的整个蛋白质组。LiP-MS是一种最近开发的不需要化学修饰研究蛋白相互作用的新方法，能够在蛋白质组范围内直接在复杂的生物环境中识别相互作用引发的结构变化。

 

当蛋白构象发生变化时（例如与小分子结合），相对于原蛋白由于位阻变化遮盖广谱酶的酶切位点，广谱酶优先切割蛋白质暴露在外的柔性部分(环或者未折叠部分)，与原蛋白相比产生不同的蛋白酶切片段。一次酶切（LiP酶切）后再将蛋白样品变性，用胰酶进行二次酶切。通过质谱检测，比较不同处理条件的样品中全酶切及半酶切肽段（LiP酶切）的信号强度变化，进而分析蛋白构象变化。

图1  LiP-MS技术原理图

 

LiP-MS技术优势

一、不需要额外的化学修饰

不需要对待研究的小分子进行化学修饰，规避了常规化学蛋白质质组学，如，基于活性的蛋白质分析（ABPP）带来的分子集团过大和修饰后活性降低等问题，增加了实验的可操作性及数据的真实性。

 

二、提供蛋白质/小分子-蛋白质相互作用（药物-靶点）的结合序列信息

小分子（如药物）的结合可以改变蛋白质的蛋白水解可及性，从而改变限制性酶（LiP）的水解模式。LiP-MS可以探测到酶的结构变化（自身的变构、酶-底物的相互作用以及酶-产物的相互作用）、蛋白质-代谢物的相互作用、蛋白质-核酸的相互作用、蛋白-蛋白的相互作用以及药物与靶点的相互作用，对感兴趣的小分子结合的蛋白质组中的蛋白质进行无偏检测，并提供结合序列的信息。

 

三、适用样本类型广

目前LiP-MS已经成功的用于蛋白质溶液、组织、细胞、细菌、酵母等不同的生物系统中，除蛋白质溶液外其他生物系统中应用LiP-MS可以探测蛋白原位结构变化。

 

四、同时检测蛋白质丰度和结构变化两个维度的信息

同时设置了仅胰酶组（TrP组）以及限制酶和胰酶组（LiP组）：仅胰酶组（TrP组）检测蛋白质丰度变化，同时对由于结构变化引起的LiP肽强度的变化与由蛋白质丰度变化引起的变化或由共价修饰、切割或序列变化引起的肽水平变化进行区分校正；限制酶和胰酶组（LiP组）则提供蛋白质结构变化信息。

 

五、检测方式灵活

根据研究需求，灵活选择靶向和非靶向的蛋白质组学检测方式。与靶向蛋白质组学结合，（例如，选择性反应检测技术（MRM/SRM）），LiP-MS方法可用于在一种或几种感兴趣的蛋白质的生物基质中以高灵敏度和再现性来探测其结构变化。

 

 

LiP-MS的应用领域

2014年LiP-MS被首次应用，经过近十年的发展，目前已经广泛应用于神经性疾病的新型生物标志物发现、药物靶点发现以及蛋白质/小分子-蛋白质相互作用相互作用图谱构建中，在解析肿瘤和疾病的发生发展、关键通路分子机制研究、新型生物标志物的发现以利于临床以及后续的药物治疗中发挥重要作用。

 

一、检测蛋白结构变化

从蛋白结构层面解析蛋白功能状态的改变，研究肿瘤和疾病患者蛋白质组结构上的不同，深入研究癌症和疾病的发生、发展机理。

 

二、鉴定新型疾病标志物

结构影响蛋白质的功能状态，通过对人类结构蛋白质组进行全局分析并判断其是否反映了病理变化，以及是否可以产生一种新型的疾病结构生物标志物，而不是传统的基于丰度的疾病生物标志物。

 

三、 发现药物靶点

通过检测药物结合靶蛋白导致的构象变化明确药物靶点，解析药物发挥作用的机制，利于疾病的治疗及药物的研发。

 

四、研究蛋白质/小分子-蛋白质相互作用

发现蛋白质/小分子（代谢物和DNA等）与蛋白质相互作用导致的结构变化，明确蛋白质/小分子（代谢物和DNA等）介导的酶、转录因子和转运蛋白等一系列调控过程如何使细胞进行正常的生命活动。

 

小编也整理了近些年的代表文章，希望能给您提供一些思路~

 

表1  LiP-MS代表文章

 

 

技术流程

青莲百奥接收对照组和处理组样品，并对两组样品平行设置TrP组和LiP组进行酶切处理，酶切后的肽段样品经质谱检测和蛋白定性及定量的搜库处理后，进行生物信息分析。分析主要分为两个维度：丰度和结构：差异蛋白筛选后进行通路富集分析和相互作用分析，其中结构差异蛋白进行了三维结构的展示，并图示结合序列信息。为进一步挖掘关键信息，我们对丰度信息和结构信息进行联合分析。青莲百奥提供LiP-MS技术服务，可以帮您设计实验指定个性化方案！欢迎大家前来咨询~

图2  LiP-MS技术流程

 

 

送样指南

青莲百奥支持接收组织、细胞和蛋白质溶液的样品，具体接收信息如下：

 

表2  LiP-MS送样指南