带你了解蛋白质组学揭示Nrf2在循环机械应力刺激成骨分化中的潜在机制。

核因子E2相关因子2（Nrf2）是抗氧化反应和细胞防御的主要转录调节因子，对调节成骨分化有重要作用。之前的研究表明，Nrf2的激活参与了循环机械应力刺激的人牙周膜干细胞（PDLSCs）成骨分化。然而，Nrf2在这一过程中的作用机制尚不清楚。2022年01月06日，青莲客户发表了题为“Nrf2 Activation Is Involved in Cyclic Mechanical Stress-Stimulated Osteogenic Differentiation in Periodontal Ligament Stem Cells via PI3K/Akt Signaling and HO1-SOD2 Interaction”的研究论文。该研究通过基于串联质谱标签（TMT）的液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析（青莲百奥提供技术支持），探索Nrf2在循环机械应力刺激成骨分化过程中在PDLSCs中的作用机制。

研究背景

牙齿正畸过程中的生物学基础是牙槽骨重塑。牙槽骨重塑是一个连续、复杂、协调的生物学过程，包括正畸中成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收。人牙周膜干细胞（PDLSCs）中机械应力刺激的成骨分化是正畸中张力侧牙槽骨重塑的重要组成部分。然而，正畸治疗中的一些风险，如附着力丧失、牙槽骨丢失以及牙龈退化，对正畸医生构成了巨大的挑战。为了避免正畸治疗过程中可能出现的副作用，改善牙槽骨重塑，目前正畸医生正在探索其分子机制，寻找潜在的治疗分子靶点。该研究旨在通过TMT蛋白质组学分析，探索Nrf2在循环机械应力刺激成骨分化中的潜在机制。作者将Nrf2激活剂t-BHQ应用于正畸大鼠，并通过免疫组织化学（IHC）染色检测成骨标志物的表达水平，以确认Nrf2可能是改善正畸牙槽骨重塑的一个有希望的治疗靶点。 

研究思路

 

 

 

 

 

 

研究结果

基于TMT的LC-MS/MS分析鉴定差异表达蛋白和生物信息学分析 

与对照组相比，共观察到162种差异表达蛋白，包括76种下调和86种上调蛋白（图1A、B）。GO富集分析显示，差异表达蛋白主要分布在细胞质、膜和细胞核中。并且这些差异表达蛋白参与了生物过程（BP）范畴内的信号转导、转运和免疫系统过程。参与了分子功能（MF）类别中的金属离子结合、受体结合和信号转导活性（图1C）。在差异表达蛋白的KEGG富集分析中（图1D），PI3K/Akt信号通路引起了作者的注意，因为它在Nrf2的激活和易位中起着至关重要的作用。在随后的研究中，选择PI3K/Akt信号通路进行进一步研究。 

 

 

图1. 基于TMT的LC-MS/MS分析鉴定差异表达蛋白和生物信息学分析

 

 

循环机械应力刺激成骨分化过程中PI3K/Akt信号通路参与PDLSCs中Nrf2的激活 

为了证实循环机械应力刺激成骨分化期间，PI3K/Akt信号通路参与PDLSCs中的Nrf2激活，该研究应用了PI3K克制剂LY294002。循环机械应力增加了Akt（p-Akt）的磷酸化，而LY294002克制了p-Akt的水平（图2A）。LY294002处理使得Nrf2的mRNA、细胞质和核蛋白表达水平下调（图2B、C）。接下来检测了在PDLSCs中有和没有LY294002的循环机械应力刺激的成骨分化能力。数据显示LY294002克制成骨相关标记物（COL1、RUNX2和OPN）的mRNA和蛋白质表达水平（图2D、E）。并且也观察到LY294002导致HO1 mRNA和蛋白质表达水平降低。上述结果表明，PI3K/Akt通路与调节循环机械应力刺激的PDLSCs成骨分化过程中Nrf2的表达有关。 

 

 

图2. 循环机械应力刺激PDLSCs成骨分化期间，PI3K/Akt信号通路参与Nrf2激活

 

 

HO1和SOD2之间的相互作用与循环机械应力刺激的成骨分化有关

之前的研究表明，循环机械应力促进了Nrf2及其下游抗氧化剂HO1的表达。PPI分析发现，HO1和SOD2之间潜在的蛋白相互作用可能与循环机械应力诱导的成骨分化有关。为了证实该结论，进行了Co-IP实验，结果证实了HO1和SOD2之间的相互作用与循环机械应力刺激的成骨分化有关。

 

 

 

图3. 循环机械应力刺激下PDLSCs中HO1和SOD2的蛋白-蛋白相互作用

 

 

Nrf2激活对正畸大鼠成骨相关标志物的影响 

为了验证Nrf2可能是正畸治疗的一个有前景的靶点，作者对正畸大鼠应用了t-BHQ（Nrf2激活剂）。免疫组化染色检测成骨相关标志物在PDL中的表达水平。结果发现t-BHQ可促进正畸大鼠张力侧PDL中Nrf2及其下游抗氧化剂HO1的表达（图4）。t-BHQ治疗后，正畸大鼠成骨相关标志物ALP和COL1的表达水平均上调（图4）。这些结果表明，Nrf2可能是一个潜在的治疗干预靶点，在正畸治疗中对牙槽骨重塑具有的作用。

 

 

图4. t-BHQ治疗正畸大鼠张力侧Nrf2、HO1、ALP、COL1表达增加

 

 

总结

综上所述，Nrf2的激活通过PI3K/Akt信号通路和HO1-SOD2的相互作用参与循环机械应力刺激的PDLSCs成骨分化。Nrf2激活剂T-BHQ可增强正畸大鼠张力侧成骨标志物的表达水平。Nrf2可能成为在正畸治疗中改善牙槽骨重塑的一个潜在的治疗靶点。

Nrf2的激活通过PI3K/Akt信号通路和HO1-SOD2相互作用参与牙周膜干细胞的循环机械应力刺激成骨分化

样本选择：人牙周膜干细胞（PDLSCs）

技术策略：TMT蛋白质组学