如约而见，甚是想念！欢迎大家来到单细胞蛋白组文献分享系列第二期，此次为大家带来的是Matthias Mann研究团队发表在Molecular aystems biology（IF=11.429）杂志上的名为“Ultra-high sensitivity mass spectrometry quantifies single-cell proteome changes upon perturbation”的文章，作者开发了一个强大的基于质谱的高灵敏度工作流程T-SCP（true single-cell–derived proteomics），将微型样品制备、极低流速色谱法和新型捕获离子迁移率质谱仪timsTOF SCP结合起来，从而使灵敏度提高了10倍以上，准确且可靠地量化单个FACS分离细胞中的蛋白质组及其变化，从而实现真正的单细胞蛋白组学。

 

蛋白质组学是对细胞、组织、器官或有机体的蛋白质进行表征。然而，对于单细胞研究是有难度的，主要由于蛋白质没有类似DNA的PCR扩增的方法，因此，任何检测蛋白质的技术都必须足够敏感，这样才能在细胞仅含有微量蛋白质时还能识别它们。这篇文章对于单细胞蛋白组的实验做了以下几方面工作：

 

 

 一

探究初始LC-MS设置的灵敏度极限

  

 

首先，作者引入PASEF（parallel accumulation–serial fragmentation 又称为并行累加–串行碎片，肽离子从捕获离子迁移率（TIMS）装置释放到浓缩包装的真空系统中）的质谱采集方案，在TIMS qTOF仪器上通过数据依赖模式（ddaPASEF）或非数据依赖模式（diaPASEF）高敏碎片化手段，可以得到很高的离子利用率和数据完整性，其中通过dda采集模式和MaxQuant分析0.8 ng HeLa裂解物共鉴定出550种蛋白质。考虑到单个HeLa细胞的蛋白质量低至150 pg ，再加上样品制备中不可避免的损失，550这个数字并非真正单细胞蛋白的结果，因此需要提高灵敏度才能实现真正的单细胞蛋白质组学。

 

 

 二

构建高灵敏度质谱系统

 

  决定MS灵敏度的三个主要因素是：电离效率，进入真空系统的传输效率和仪器对离子的利用度。所以研究者进行了以下几方面的改进：

 

（1）开发了一个较强的离子源，引入了全新的离子光学元件，优化检测器电压等参数，之后将离子电流增加了4.7倍，构造了一个具有较亮离子源的仪器。接下来对FACS方式分选的0,1和6个HeLa细胞分拣到不同的384孔中，分别进行蛋白处理进行检测，分别识别出824、1364和1946种蛋白质，结果表明与比较六个细胞相比，单细胞的定量准确率没有太大降低。

 

（2）研究人员发现通过把样品负载和梯度形成与LC-MS运行分离，并以1 ul / min的标准流速运行，可以实现高重现性。系统流速由单个泵控制，流速降至25 nl / min时仍可以稳定运行。（3）样本制备方面，使用了用于PCR反应的384孔板来为细胞裂解和蛋白质消化提供通用、自动化的小体积环境。同时，比较正常的1 uL / min和100 nL / min流速下的残留时间，发现降低流速导致信号增加了十倍。然后，结合极低流量色谱和diaPASEF模式，能从1ng样本中对3900多种HeLa蛋白进行鉴定和定量，具有高可重复性。

 

在此，作者利用基于MS的T-SCP技术和微量样本处理系统，极低流量的色谱法和diaPASEF采集模式与之前的方法相比，识别的蛋白数量显示出显著的优势。

 

 

 三

方法验证-T-SCP剖析被捕的细胞周期状态

 

 

  作者把单细胞水平上检测出对药物扰动的生物反应作为T-SCP蛋白质组学工作流程的实际应用场景，使用胸苷thymidine和nocodazol诺考达唑处理HeLa细胞后，刺激产生了四个在特定细胞周期阶段富集的细胞群。通过前述方法，对每个单细胞的蛋白进行数量统计，多可达2083个，共定量1305种蛋白，单细胞定量数高达到1209种。蛋白信号求和后，G1和G1 / S细胞，G2和G2 / M细胞的蛋白质含量均有所不同，T-SCP这个蛋白质组学工作流程正确地反映了增殖状态，同时突出了每个细胞周期阶段内的异质性显著。

 

 

类似于scRNA-seq在细胞类型和状态发现领域的应用，研究者根据参考文献筛选出了的G2 / M，G1和S期中差异显著的20种蛋白作为标记蛋白，建立细胞周期阶段分类器，可以根据G2 / M阶段评分对G2 / M和G1 / S进行区分（AUC=0.895）。同时，对数据进行标准化和过滤后对蛋白进行差异性表达分析，识别出了重要的细胞周期调节蛋白。

 

 

 

 四

单细胞蛋白组与单细胞转录组差异

 

  接下来，研究者将单细胞蛋白质组学测量结果与scRNA-seq数据进行了比较，单细胞转录物表达水平在scRNA-seq技术之间具有很好的相关性，但与单细胞蛋白质测量值却没有相关性。这表明单细胞蛋白质和RNA的水平有很大的不同，这意味着RNA和蛋白质存在不同的调节机制，单纯的RNA测序所获得的信息是有限的。

 

 

 

 五

单细胞核心蛋白组

 

  

 

比较单细胞蛋白质组测量和六细胞蛋白质组结果显示此方法可以鉴定大部分稳定表达蛋白。低表达蛋白的CV服从泊松分布，但在高表达蛋白中CV显著降低，这说明低水平表达蛋白的测量变异性受技术敏感性限制。

 

总结：

该方法可以容易地应用于组织材料的高敏感性分析，以获得的健康和疾病状态的细胞异质性，可以在样本受限的情况下提高测定灵敏度，促进了单细胞蛋白组学的发展。

 

DOI:10.15252/msb.202110798