背景

 

目的

作者在此利用宏基因组学和宏蛋白质组学两种技术手段，对糖耐量正常个体（NGT，n=97）、糖尿病前期患者（Pre-DM，n=80）和未经治疗的2型糖尿病患者（TN-T2D）的粪便样本进行分析，研究糖尿病前期和治疗初期T2D个体肠道微生物群的组成和功能变化以及微生物和宿主蛋白质的粪便含量，以阐明不同疾病阶段的宿主与微生物相互作用关系。    

研究结果

一、中国糖尿病前期和2型糖尿病患者的不同宏基因组图谱 使用BGISEQ-500平台对254份粪便DNA样本进行鸟枪式宏基因组测序，未发现NGT、Pre-DM和TN-T2D个体之间基于微生物基因的丰富度、α多样性和β多样性存在显著差异。接下来使用宏基因组关联分析（Metagenome-wide association analysis，MWAS），确定了266015个T2D相关基因（KW检验，p<0.05），并将这些基因聚类为126个宏基因组连锁群（Metagenomic linkage groups，简称MLGs）。进一步应用KW检验来检测NGT，Pre-DM和TN-T2D个体之间MLGs在相对丰度上是否有统计学差异：与NGT个体相比，Pre-DM或TN-T2D个体中来自梭状芽胞杆菌类的MLG丰度明显较低（图2A）；与NGT和TN-T2D个体相比，Pre-DM中产生盐的普拉梭菌丰度较低（图2A）。相反地，与NGT相比，注释到大肠杆菌、唾液链球菌与伊格尔兹氏菌的MLGs在Pre-DM中具有很高的丰度（图2A）。紧接着，这些重要的发现，作者利用94例来自上海的TN-T2D患者的粪便样本进行宏基因组测序结果在队列中得到了验证。为了评估MLG在T2D中的辨别力，并确定区分不同疾病阶段的关键MLG个体，作者构建了随机森林（RF）分类模型，RF模型在两个不同疾病阶段的样本分类方面表现良好，ROC曲线下面积（AUC）值从0.90到0.94（图2B）。除了未分类的MLGs以外，用于区分TN-T2D和NGT的最具辨别力的MLG是粘液曲霉（Akkermansia muciniphila），对prausnitzii和大肠杆菌进行注释的MLG在将DM前期样品与TN-T2D和NGT样品分离方面都显示出重要作用（图2C），这表明prausnitzii F.丰度较低，而大肠杆菌在Pre-DM个体中有丰度较高的独特微生物DNA特征。KEGG富集表明NGT、Pre-DM和TN-T2D个体中微生物功能可能存在差异模式，与NGT个体相比，Pre-DM肠道菌群中多种模块富集，包括糖磷酸转移酶系统（PTS），氨基酸ABC转运蛋白和细菌分泌系统等（图2D）。TN-T2D中也具有类似富集；此外，与NGT和TN-T2D个体相比，Pre-DM个体在几种能量和核苷酸代谢模块方面表现出显著降低（图2D）。通过排除大肠杆菌基因，进行第二轮KEGG富集分析，发现多种Pre-DM富集的模块在Pre-DM和NGT个体之间无显著差异，这表明大肠杆菌可能是Pre-DM相比于NGT功能差异的重要贡献者。综上所述，这些结果表明，在糖尿病前期，与疾病相关的肠道微生物组成和功能可能发生重大变化。   二、肠道宏蛋白质组学同时确定粪便中微生物和人类蛋白质的水平 使用基于质谱的iTraq标记蛋白质组学对84例样本粪便进行研究，共鉴定出15670个蛋白质，包括15245（97.29%）个微生物蛋白质和425（2.71%）个人类蛋白质。一种微生物肽通常与多个具有高度序列相似性的蛋白质相匹配，导致难以识别单个肽的微生物来源，进行蛋白质去冗余后共11980个非冗余蛋白质，这些独特肽的相对强度进一步用于元蛋白定量。比较发现三组之间仅共享2782个蛋白，表明各组之间蛋白质水平上的微生物表达模式不同。与其他组相比，分类学注释表明Pre-DM个体中独特的变形杆菌蛋白的比例更高。  三、宏基因组和宏蛋白质组之间微生物群特征的一致性和不一致性

接下来在DNA和蛋白质水平上研究了微生物组成和功能的一致性以及差异。门水平上90％以上的基因和蛋白始终被分配到厚壁菌门，拟杆菌门和变形杆菌门。总体有一致性，但拟杆菌门具有更高的蛋白注释比例（41%），而基因注释比例为（25%）（图3A），这表明在84个样本中，拟杆菌可能表现出比其他门更高的蛋白质产量。属水平上，宏蛋白质组81个属，而宏基因组鉴定到212个属。随后进行了Spearman秩相关分析，以确定基于宏基因组学的宏蛋白数量与属级丰度之间的关系，拟杆菌属、普氏菌属、普拉梭菌属包含大部分的宏蛋白（图3B）。

比较基于宏基因组学和宏蛋白质组学数据的KEGG功能类别，观察到两个数据集之间单个类别的相对贡献存在很大差异（图3C），24%和18%的蛋白质被分配到碳水化合物代谢和翻译类别，而这两个类别的相应宏基因组百分比分别只有11%和4%（图3C）。1508个蛋白可归属于10个KEGG直系同源物（KO），主要为Ca激活的氯离子通道(K07114)、持家蛋白（K02355，K02358和K02395）等（图3C）。变形菌门宏蛋白质（主要来自大肠埃希氏菌，柠檬酸杆菌和肠杆菌）在Pre-DM显示增加的趋势，而拟杆菌属的宏蛋白倾向于在TN-T2D富集（图3D）, 与Pre-DM和TN-T2D相比，在NGT中参与碳水化合物糖代谢的宏蛋白水平较低（图3E）。

 四、T2D患者粪便中人类排泄蛋白的功能特征 

在检测到的425种人类蛋白质中，确定了218种在NGT、前DM和TN-T2D组之间共享的人类蛋白质。接下来，我们用基因本体（GO）术语对人类蛋白质进行注释，包括几种肠粘蛋白以及膜联蛋白的成员。233种人类粪便蛋白质具有组织特异性注释，151种蛋白质在消化系统中表现出高表达，其余蛋白质被注释为在血液或其他组织（如表皮）中高表达。

发现粪便中存在的49种人类蛋白质在至少两组之间表现出较高或较低强度的趋势（图4A）。据报道可抑制变形杆菌门中几种生物体生长的抗菌组织蛋白酶G的水平在Pre-DM样本中往往高于NGT和TN-T2D，这与组织蛋白酶G的已知抑制剂α-1-抗胰蛋白酶和α-1-抗胰蛋白酶的水平较低有关（图4A），这表明糖尿病前期患者可能已经开始采取策略，激活防御系统，对抗大肠杆菌相对丰度的增加。网络分析显示，在NGT、前DM和TN-T2D个体之间的两两比较中，20种人类蛋白质之间的相关性显示出与富集相关的不同趋势（图4B）。

为了研究人类肠道中可能存在的宿主-微生物-蛋白质相互作用，接下来将研究区分性细菌和人类蛋白质之间可能存在的相关性。发现Pre-DM富集的大肠杆菌蛋白质与参与先天免疫反应和粘附的人类蛋白质之间存在显著的负相关，而大肠杆菌蛋白质与组织蛋白酶G、细胞色素c（CYC）和胰蛋白酶之间存在正相关（图4C）。

 

结论

本研究在宏基因组学和宏蛋白质组学水平上揭示了大量Pre-DM相关特征。与NGT相比，Pre-DM和TN-T2D中几种产dingsuan菌的相对丰度较低。肠杆菌科物种丰度较高（以大肠杆菌为主），宿主蛋白水平较低，可能参与糖尿病前期蛋白细菌特异性反应。宏蛋白质组学不仅为估计微生物蛋白质的表达提供了有价值的补充，而且也为描述不同疾病阶段的宿主-微生物蛋白质相互作用提供了有价值的补充，TN-T2D和Pre-DM个体相比，NGT个体中几种宿主源性AMP水平更高的趋势，这表明NGT个体中可能有更强的宿主防御入侵（疾病相关）微生物的能力。糖尿病前期患者在过渡到T2D之前，肠道生态系统可能存在独特的非线性变化。

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