三阴性乳腺癌（TNBC）是一种异质性的疾病，也是目前乳腺癌治疗中最棘手的一种，死亡率最高、且最容易复发。临床上，由于缺乏分子靶点，TNBC的治疗受到限制，与其他类型的乳腺癌患者相比，患者的预后和总生存期较差。因此，临床上迫切需要开发靶向 TNBC 疗法。外泌体由多种细胞类型释放，存在于生物体液中，并已被确定为肿瘤进展的重要介质。且已发现 TNBC 衍生的外泌体在癌症进展中起关键作用。因此，分析外泌体的蛋白质特征是 TNBC 治疗中一种很有前景的策略。

文章标题：Proteomic Landscape of Exosomes Reveals the Functional Contributions of CD151 in Triple-Negative Breast Cancer.（IF =7.381）

发表时间：2021.07

背景

三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌的一种侵袭性亚型。由于分子治疗靶点有限，TNBC 患者的总生存期较差。外泌体被认为是癌症进展的关键介质，但TNB 衍生的外泌体的分子成分和功能仍然未知。建立更全面的TNBC患者外泌体蛋白质组学图谱，探索DEPs在外泌体中的功能，对临床医生和研究人员具有重要价值。

文章重点

使用定量蛋白质组学比较了来自TNBC患者和健康供体的血清外泌体的完整蛋白质表达特征，发现CD151在TNBC衍生的外泌体中高度富集。CD151通过外泌体调节核糖体和补体蛋白的分泌，CD151缺失的外泌体显著降低了TNBC细胞的迁移和侵袭。TNBC衍生的外泌体蛋白分析是扩展对TNBC理解的有用工具，外泌体CD151可能是TNBC的潜在治疗靶点。

研究思路

研究内容

01血清外泌体的鉴定和表征通过超速离心从血清样品中分离外泌体。使用透射电子显微镜 (TEM)、免疫印迹和 NTA 来表征血清外泌体，确定分离的外泌体的相对纯度和形态。TEM分析表明，分离出的纳米囊泡具有典型的杯状结构，直径在30~150 nm范围内。WB分析显示，在样品中检测到了外泌体蛋白标志物TSG101、HSP70、Alix和CD63，而钙网蛋白是一种内质网驻留蛋白，仅在MDA-MB-231全细胞裂解物中检测到。NTA 显示，经过2000 倍稀释后，粒子的浓度约为5.7×10⁷ ，模式尺寸约为111.8 nm，与外泌体的大小一致。结果表明外泌体通过各种测定得到了很好的表征并且高度纯化。

02TNBC 患者和健康供体的外泌体的蛋白质组分析

作者采用 TMT 定量蛋白质组学技术分析来自 TNBC 患者和健康供体的外泌体样本（10名TNBC 患者和17名健康受试者）,在TNBC 衍生的外泌体中鉴定出共 1050种蛋白质。使用组t检验并分别识别了96个DEP 与TNBC衍生的外泌体蛋白相关变化（FC > 1.5；FDR < 0.01）。层次聚类的进一步分析表明，单个样本被分为两个聚类。在批次 A 中观察到轻微的批次效应，但生物学参数（患者组和健康组）紧密地聚集在一起，表明数据适合于提取有意义的生物信息。同时，这些结果还表明，各组内蛋白质的表达水平存在差异，表明个体之间存在差异。

为了探索已识别的 DEP 的功能，对 DEP 进行通路富集分析。发现TNBC 衍生的外泌体可能通过传递细胞信息在整合素调节的肿瘤转移中发挥重要作用。受试者的外泌体中下调 DEP 在与补体和凝血级联相关的蛋白质中显着富集。也参与到补体的初始触发、血液凝固、蛋白水解的负调节、细胞杀伤和内吞作用之中。为了在上述富集途径中找到枢纽蛋白，作者将与这些途径相关的蛋白质输入到STRING数据库中以构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，并在cytoHubba中执行最大团中心性算法，以及具有前五个最大团中心性的蛋白质值被过滤为中心蛋白。在补体和凝血级联通路中靠前的蛋白质包括C8、VTN、C5 和C9。在整合素细胞表面相互作用和黏着斑信号通路中，ITGB1 是该算法的蛋白质。此外，在 ITGA6-ITGB1-CD151 复合物中，外泌体整合素（ITGA6 和 ITGB1）已被证明可促进肺转移，因此中枢蛋白 CD151 可能通过调节整合素分泌在 TNBC 中发挥重要作用。 为了验证 MS 结果，选择补体和凝血级联通路中的中枢蛋白C5、整合素细胞表面相互作用通路中的ITGB1和ITGA6-ITGB1-CD151 复合物中的CD151 进行验证。来自另外12名TNBC 患者和12 名健康供体的血清样本通过WB进行了独立评估。与健康供体样品相比，TNBC血清样品中CD151和ITGB1的相对表达水平升高，而C5水平降低，与蛋白质组学结果一致。

03CD151 在TNBC患者来源和MDA-MB-231细胞来源的外泌体中显着富集CD151在癌症中的作用已有越来越多的证据，由于从未报道过CD151在TNBC 外泌体中的作用，被作者选中进行进一步研究。作者验证了来自 TNBC 血清样本、乳腺癌细胞裂解物和来自乳腺癌细胞的外泌体中CD151的表达。结果表面与正常志愿者来源的外泌体相比，CD151 在TNBC来源的外泌体中显著表达。表明外泌体CD151可用作区分 TNBC 患者与健康受试者的生物标志物。此外，作者在一组五个乳腺癌细胞系中测试了CD151表达水平。CD151在TNBC细胞系MDA-MB-231中上调明显。同时在源自这些乳腺癌细胞系的外泌体中评估了CD151水平，发现CD151在TNBC细胞系MDA-MB-231分泌的外泌体中显著富集。

04CD151 通过外泌体调节多种蛋白质的分泌为了测试CD151的功能，作者在MDA-MB-231细胞中使用 CRISPR-Cas9技术敲除CD151。对CD151KO (231-CD151KO) 和对照细胞 (231-Control) 进行WB检测。CD151蛋白表达在231-CD151KO中完全消除，说明CD151被成功敲除，并且在外泌体中观察到相同的结果（231-CD151KO-Exo与231-Control-Exo）。接下来进行外泌体和细胞蛋白的稳定同位素 6-plex TMT 标记。通过定量蛋白质组学对 2032 种外泌体蛋白和 6849 种细胞蛋白进行了定量。对于细胞蛋白质组和细胞衍生的外泌体蛋白质组，我们通过 Pearson 相关性获得了 0.999和0.998 的平均相关性。发现 231-CD151KO-Exo 和231-Control-Exo 中的外泌体蛋白谱存在显着差异，但231-CD151KO 和 231-Control 细胞中的这些蛋白略有不同。表明 CD151 可能通过外泌体调节许多蛋白质的分泌，而不是控制它们在细胞中的表达。

05CD151 通过外泌体促进核糖体蛋白分泌并抑制补体蛋白分泌在量化的外泌体蛋白中，759 种蛋白表现出高（>1.5）的 KO/WT 比率，表明CD151抑制了这些外泌体蛋白的分泌。相比之下，481 种蛋白质的 KO/WT 比率较低（<0.667），表明CD151增强了这些外泌体蛋白的分泌。然而，在量化的细胞内蛋白（6849）中，仅鉴定出 64 个DEP。表明 CD151通过外泌体调节大量蛋白质的分泌，而不是调节它们的表达。KEGG对 exo-DEP 的分析表明，DEP 参与了补体和凝血级联反应、冠状病毒、细胞外基质-受体相互作用、核糖体和内吞作用。231-CD151KO-Exo 中高表达的蛋白质在补体和凝血级联、氨基酸生物合成、内吞作用、粘着斑和血小板活化中富集。这些结果表明，CD151可能通过TNBC 患者的外泌体抑制补体相关蛋白的分泌。在下调的Exo-DEP 中，46 个是核糖体蛋白。为了研究这些蛋白质的分泌是否受CD151 的调节，挑选了六种核糖体蛋白（RPL6、RPL13、RPL24、RPS3A、RPS8和RPS10）和三种补体蛋白（C3、C5 和C7）。与231-Control-Exo 相比，六种选定的核糖体蛋白在 231-CD151KO-Exo 中的表达水平较低，但三种补体蛋白在 231-CD151KO-Exo 中的表达水平高于 231-Control-Exo，与蛋白质组学数据一致。这些发现表明外泌体 CD151 促进核糖体蛋白分泌并通过外泌体抑制补体蛋白分泌。 

06CD151 外泌体 CD151 在体外促进 TNBC 细胞迁移和侵袭为了验证外泌体 CD151 是否在体外促进 TNBC 细胞移动性和侵袭性，将 TNBC 细胞系（MDA-MB-468和MDA-MB-231）、对照外泌体和 CD151KO 外泌体共培养 24 小时。Transwell 实验表明，与PBS 对照组相比，231-Control-Exo培养的MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞表现出增强的细胞迁移和侵袭能力。外泌体中CD151的消耗降低了 MDA-MB-468 和MDA-MB-231 细胞的迁移率。与231-Control-Exo 组相比，其消耗也下调了MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞的侵袭潜力。证明了外泌体CD151 在调促进TNBC细胞迁移和侵袭方面的功能。

 

总结：

作者从 TNBC 患者中鉴定出1050 种外泌体蛋白，分析了总共 96 个DEP 。发现已鉴定的DEP 参与整合素细胞表面相互作用、调节胞吐作用、ITGA6-ITGB1-CD151 复合物以及补体和凝血级联反应。而后将 CD151 鉴定为一种在来自 TNBC 患者血清和 TNBC 细胞培养上清液的外泌体中高度表达的蛋白质，表明 CD151 在血清外泌体中的表达增加可能是 TNBC 的诊断生物标志物。证明了CD151 在调节蛋白质分泌和促进 TNBC 细胞迁移和侵袭方面的功能。