近年来乳腺癌的基因组分型取得了进展，乳腺癌的基因组分类器（如基于RNA的PAM50）被越来越多地用作识别乳腺癌分子亚型和推荐临床使用的生物标志物的金标准。但由于乳腺癌高度异质性的存在，其仍然还有许多局限性，而且目前的临床诊断和治疗决策通常是基于蛋白质水平的信息。 加拿大不列颠哥伦比亚大学的研究团队于2022年3月7日在Nature Communications发表了题为“Proteomic analysis of archival breast cancer clinical specimens identifies biological subtypes with distinct survival outcomes”的论文。研究人员对来自于两个队列的300例FFPE乳腺癌标本进行了全面的蛋白质组学分析，以临床适用的方式描述了乳腺癌的异质性，确定了潜在的生物标志物和治疗靶点，并为临床乳腺癌的分型提供了参考。 实验组：两组乳腺癌诊断患者队列2008-2013年（n=178）和1986-1992年（n=122），共300例FFPE乳腺癌标本。样本中PAM50的四个分型（Basal-like、Her2-enriched、LumA、LumB）各75例，其中08-13队列包括由IHC检测确定为TNBC（三阴性乳腺癌）的88例病例，各队列样本的PAM50亚型分布见下图。

正常组：来自乳腺缩小术的正常乳腺组织样本38例。

 

研究思路

研究人员使用了高灵敏度的基于MS分析的蛋白组学方法，采用优化的FFPE标本微量蛋白质组处理SP3-CTP工作流程和TMT定量标记技术。

 

研究结果

 01FFPE 乳腺癌组织样本的蛋白质组学分析和研究队列的特征蛋白质组学分析共定量了9088个蛋白，其中4214个蛋白在所有样本中共有的。其中08-13队列的病例包含所有的75例基底样和88例由IHC检测确定为TNBC（三阴性乳腺癌）的病例，因此该队列是研究的重点，其中88例TNBC作为单独的一个队列进行分析。

 

02关键亚型特异性乳腺癌蛋白的表达与亚型的生物学特征一致

研究人员分析了乳腺癌生物标志物的蛋白丰度包括49个PAM50蛋白，是否与每个亚型的生物学特征相一致。在亚型2中，基底细胞角蛋白(KRT5、KRT17、KRT14)高表达，增殖标志物MKI67在亚型2中较高，而在亚型4中较低（图2）。管腔型生物标志物包括ESR1、FOXA1和KRT18在亚型3中显著降低，但在亚型1和亚型4中显著升高。Her2生物标志物(ERBB2，GRB7)在亚型1中显著升高。PRKDC是CPTAC(临床蛋白质组学肿瘤分析联盟)报道的一个基底样亚型特异性生物标志物在亚型2中显著升高。

图2：四个蛋白质组簇中关键亚型特异性乳腺癌蛋白的相对蛋白丰度

03三阴性乳腺癌由四个临床上不同的蛋白亚型组成

PAM50基底样亚型在临床上近似于TNBC（三阴性乳腺癌）IHC状态。研究人员分析了88例均在08-13个队列中的，且由IHC定义的TNBC病例(通过基于RNA的PAM50分析为：61个基底样病例，22个HER2富集病例，5个管腔B病例)。对高变化蛋白(n=1055)无监督聚类分析确定了4个稳健的聚类（图3a），其RFS和OS的预后有显著差异。TNBC-亚型1主要由基底样病例组成，与其他亚型相比具有好的生存率。

图3：蛋白质组学分析显示08-13队列中TNBC中有4个临床重要亚型

 

TNBC-亚型1病例TIL含量高，TAP1和HLA-DQA1表达高，因此称为基底免疫热型。TNBC-亚型2主要是基底样病例在ECM、凝血和体液免疫反应中表达丰富，其中CLDN3 和分化的管腔细胞表面标志物 MUC1 和 EPCAM32 的显著低表达；因此称为间充质细胞。TNBC-亚型3 主要是 PAM50的 Her2- Enriched病例，该亚型高表达管腔细胞角蛋白 7、8、18、19 和催乳素诱导蛋白（PIP）；即命名管腔。TNBC-亚型4 都是基底样病例，生存期差，富集了 DNA 复制和细胞周期蛋白，几乎没有免疫相关的肽和极少的 TIL；因此称为基底免疫冷。

04蛋白质组学特征揭示管腔乳腺癌的生物学异质性

86-92个队列中的110个样本进行一致性聚类分析得到三个主要的亚型（图4）。86-92亚型1和2主要是管腔A型，86-92亚型3主要是管腔B型。亚型1中RNA处理和剪切过程的蛋白高表达，但是缺乏参与抗原处理和提呈以及I型和II型IFN信号的免疫相关蛋白。亚型2富集基质蛋白和ECM成分，包括一些胶原蛋白成员（称为管腔A基质富集）。亚型3高表达和DNA复制、细胞周期、DNA损伤反应和免疫反应相关蛋白，包括MHCI类抗原加工和呈递，以及T细胞信号转导，与亚型1和2相比，参与ECM、凝血、上皮细胞分化和对雌激素和类固醇激素反应的相关蛋白是降低的。

 图4：86-92队列中管腔乳腺癌的生物学异质性

 

此外，研究人员试图通过将单个蛋白的持续增加和RFS关联起来，在10年或更长时间的长期随访中确定可能与他莫昔芬获益或耐药性相关的单个候选蛋白。多重校正测试确定脂肪酸结合蛋白7（FABP7）是与他莫昔芬治疗后与RFS>10年相关的候选生物标志物。
总结

研究人员对FFPE标本进行蛋白质组分析，结合相关的结果数据，以一种可靠且临床适用的方式表征了乳腺癌的异质性。免疫差异、细胞外基质和脂质代谢途径的研究结果具有潜在的临床相关性。此外，本研究确定了用于深入分析现有存档的临床试验FFPE标本的候选蛋白质，为开发乳腺癌的诊断和预后生物标志物提供了宝贵的资源。

利用蛋白组学研究具有不同生存结果的乳腺癌亚型

期刊名称：Nature Communications

影响因子：12.121

样本选择：300 例确诊患者的FFPE 乳腺癌手术标本

技术策略：TMT蛋白质组学