标题：Proteogenomics refines the molecular classification of chronic lymphocytic leukemia 期刊：Nature Communications（IF =17.694） 时间：2022.10  背景
慢性淋巴细胞白血病（CLL）是一种常见成人白血病。特征是外周血，骨髓和淋巴结中成熟B淋巴细胞的积累。该恶性肿瘤具有非常异质的临床病程。部分患者可以遵循“观察与等待”策略多年，而另一些患者则需要频繁治疗且总生存期较短。质谱的发展促进了肿瘤标本的平行深层蛋白质组学分析。癌症在蛋白质组水平上的异质性可用于解释基因组和转录组学诊断方法之外的治疗反应和预后差异。蛋白质组学与基因组学等其他数据的整合已经开始增强对癌症实体的理解。然而，在临床相关靶点和功能表型方面大多缺乏以蛋白质组为中心的数据整合。蛋白质组学与疾病分类的相关性在临床异质性癌症实体，如慢性淋巴细胞白血病（CLL）中仍有待确定。

 文章重点 在临床特征良好且具有代表性的 CLL发现队列中进行了蛋白质组和转录组以及基因和离体药物反应分析。基于蛋白质组学，通过无监督聚类区分了六个亚组。在六个已确定的亚组中，发现了一个只在蛋白质组水平上检测到的未知CLL患者亚群。特征表现为与异常剪接相关的剪接体蛋白丰度提高和B细胞受体信号蛋白丰度降低。该结果可将剪接体蛋白丰度与CLL中的异常剪接和不良结果联系起来。多组学分析完善了CLL的分类，并强调了蛋白质组学在改善癌症患者分层方面的潜力。  技术路线   研究内容 01

基因型分子表型关系

为了探索基因型与表型的关系，作者对已知的CLL基因突变、mRNA表达和蛋白质丰度之间的关系进行研究。首先分析了与CLL基因突变相关的蛋白质丰度，发现12号染色体对差异蛋白质丰度的影响大。同时，12号染色体也与许多显著的基因表达变化有关。而后进一步研究了与12号染色体相关的蛋白质丰度变化是否与基因剂量效应有关。结果显示虽然染色体增加了位于12号染色体上的蛋白质丰度，但63%被确定为差异的蛋白质是由位于其他染色体上的基因表达的。尽管像12号染色体或体细胞突变的存在转化为mRNA和蛋白质水平的变化，但蛋白质丰度与相应mRNA水平之间的总体相关性很低。表明癌症蛋白质组的翻译后调节范围很广。    相关性分析显示与12号染色体或IGHV突变状态相关的差异的蛋白质表现出更高的mRNA -蛋白质相关性。而与SF3B1突变相关的差异蛋白质并非如此，证明了12号染色体和IGHV突变在CLL中蛋白质丰度变化与基因表达变化之间的直接联系，而SF3B1突变的致癌作用是由转录后机制引起的。在对基因型与差异蛋白关系研究中作者发现，突变样品中肿瘤抑制蛋白ATM和核转运蛋白XPO1的蛋白水平低于野生型样品。这种关联仅在蛋白质上观察到，而不是在转录本水平上观察到。表明CLL蛋白质组不仅显示出mRNA水平上也存在的许多变化，而且还揭示了转录组中不明显的生物学关系。 
  02综合分析揭示与结局相关的蛋白质组学因素进行了无偏、无监督的多组学因子分析（MOFA），以获得多个数据集的协变量的综合视图。MOFA揭示了11个潜在因素（LF），只有LF1、LF2和LF9与下一次治疗的时间（显著相关。LF1和LF2在所有数据（蛋白质组、RNA和基因组）中表现活跃，并且主要由基因组数据中的12染色体和IGHV突变驱动。在发现队列中，LF1和LF2中的蛋白质不仅与显著相关，在蛋白质组学验证队列中也与总体存活率显著相关。除了LF1和LF2之外，LF9仅在蛋白质组学数据中有活性表现。MOFA分析表明了蛋白质组学分析揭示了其他组学数据无法检测到的临床相关生物学内容。

  03基于蛋白质组学的CLL分层确定了六个不同的亚组 由于发现蛋白质组学与临床治疗时间的独有关联，作者决定深入探索蛋白质组学数据。为了描述患者蛋白质谱之间的相似性和差异性，对蛋白质数据集进行了一致性聚类。聚类确定了六个蛋白质组（PGs），而后分析了是否有基因突变与不同的PGs相关。有4个PGs分别代表12染色体/MCLL（Tris12M-PG，n = 9）、12染色体/U-CLL（Tris12U-PG，n = 8）、M-CLL（M-PG，n = 18）和U-CLL（U-PG，n = 17）。其中1例Tris12M-PG患者被注释为12染色体阴性，携带12亚克隆染色体。Tris12M-PG、Tris12U-PG和M-PG在未经治疗的患者中均有富集作用。第五个亚组TP53- PG，虽只包含4个患者样本，但4个样本中有3个存在TP53突变。另外发现了一个新的基于蛋白质组学的分组，与所有其他组相比，该组与已知的基因突变类型没有任何关联，且只有12染色体不在此组之中。为了将这些基于蛋白质组学的分组与转录组联系起来，对相应的转录组数据进行了共识聚类。基于转录组的亚群仅与蛋白质组部分重叠。转录组1-3与蛋白组Tris12U-PG、Tris12M-PG、M-PG和U-PG之间存在对应关系，但没有基因注释的新亚组（New-PG）和TP53-PG（TP53）被划分为多个转录组亚组。   作者进一步调查了所有PGs的药物反应概况。尽管效应量不同，但各组对大多数CLL相关药物有反应。只有TP53突变组TP53-PG对包括化疗药物在内的许多药物的总体反应较差。


基于蛋白质组学的分组将不同的患者分开，显示了各亚组的临床相关性。虽然新的PG对突变的TP53和未突变的IGHV基因等高危因素没有富集，但它具有短的且所有PGs的体内淋巴细胞倍增时间快，表明这些肿瘤的增殖能力增加。相比之下，M-PG（M-CLL，无12染色体）的T明显长于所有其他亚组。综上所述，相对蛋白丰度的无监督聚类将CLL患者分为6个临床相关组，其中5个可以用已知的基因特征来解释，而一个结果不良的新亚组仅基于蛋白质组学来识别。

  04新不良结果组ASB-CLL的细胞过程失调新的不良结果亚组约占发现队列的20%，且只能在蛋白质水平上被识别。为了描述该组中哪些途径和过程发生了改变，分析了新PG和其他PGs之间的差异蛋白质丰度。富集分析确定BcR信号蛋白如BTK、PLCG2和PIK3CD是新PG中下调显著的蛋白。尽管IGHV突变是CLL34中BcR活性的重要替代物，但新PG中这些中枢BcR信号成分的下调独立于IGHV突变。在基质细胞和CLL细胞共培养模型中进一步测量了样本对伊布替尼的体外反应，发现新PG对BcR抑制剂伊布替尼的反应较低。此外，BcR信号蛋白的磷酸化水平在新PG中也表现出类似的下调。

 新PG的进一步特征是参与支链氨基酸（BCAA）降解的酶的上调和蛋白酶体蛋白的下调，与剪接体相关的蛋白质在新PG中表达显著。作者将该组命名为ASB-CLL。观察到剪接体成分的蛋白质和相应mRNA水平之间的相关性非常低，解释了在转录组水平上不能检测到ASB-CLL的原因。剪接因子突变（例如SF3B1突变）在CLL中反复发生，但SF3B1的突变在ASB-CLL中既不富集也不缺失。SF3B1突变型和野生型CLL患者之间的SF3B1蛋白水平没有差异，但ASB-CLL患者的SF3B1蛋白水平明显高于其他亚组。相关研究称，SF3B1突变的主要致癌效应是通过在肿瘤抑制基因BRD9中包含毒物外显子，然后下调BRD935来介导的。但ASB-CLL中未检测到BRD9错剪接或下调。对于12例ASB-CLL患者中的10例，作者进一步对肿瘤和匹配的正常对照进行了全外显子测序，以探讨是否可以在该亚组中发现剪接体蛋白中的任何其他体细胞突变。除了SF3B1突变患者中的DDX5突变外，未检测到任何其他剪接因子突变。结果表明，在ASB-CLL中检测到的剪接体蛋白丰度增加与剪接体突变无关。   为了进一步确定ASB-CLL中剪接体的上调是否有任何功能后果，作者分析了该组的mRNA和肽水平上的选择性剪接。使用转录组数据和rMATS注释所有患者的所有可能的选择性剪接情况。从1000个选择性剪接事件中计算了每个患者的平均剪接百分比（PSI）值。ASB-CLL与所有其他亚组之间的比较显示，ASB-CL的外显子使用情况不同，跳过的外显子更少，3′和5′剪接位点使用更多。此外，观察到平均剪接体蛋白丰度与上述平均PSI值之间存在统计学显著相关性。作者检测到427个外显子跳跃事件，与所有其他蛋白质组亚组相比，ASB-CLL具有明显不同的选择性剪接模式。这些外显子跳跃事件在ASB-CLL中的发生率明显高于偶然发生的预期。未观察到差异外显子跳过事件对编码区或非翻译区的偏好。在肽水平上也检测到ASB-CLL的显著不同的外显子使用。因此，ASB-CLL的特征是BcR通路成分的丰度较低，BcR成分的磷酸化水平较低，剪接体功能发生改变。 
  05ASB-CLL在独立队列中的验证 为了在DIA蛋白质组学中可靠地检测ASB-CLL，在HiRIEF数据集中对所有BcR和剪接体蛋白训练了k-top评分对（k-TSP）分类器。将分类器应用于Validation1_DIA队列，识别出28例ASB-CLL患者（10例未治疗，15例预治疗，3例未知），对应于17%的患者。ASB-CLL的这一比例与训练数据集相似。正如预期，ASB-CLL中BcR蛋白下调，剪接体蛋白上调。此外，ASB-CLL的特征是BCAA蛋白上调和蛋白酶体蛋白下调，这与发现队列中观察到的结果一致。ASB-CLL患者的总体生存率明显较差，在从未接受治疗的患者获得的样本亚组中得到证实。Eagle及其同事将k-TSP分类器应用于独立队列，该队列包括9名U-CLL和9名M-CLL患者。此外，将k-TSP分类器应用于蛋白质组学数据集，该数据集包含与作者的研究重叠的患者（91例CLL患者中的30例），但该数据集是在使用DIA蛋白质组学的不同实验室中独立生成的。91例CLC样品中，共有9例（10%）被分类为ASB-CLL，可以确认以ASB-CLC蛋白质组谱为特征的患者的不良结果。 

  06细胞来源对12染色体对蛋白质组和临床结果的影响 为了了解IGHV和12染色体对蛋白质组的影响，对发现队列中独立于亚组的所有样本进行了相关网络分析，以确定CLL蛋白质组中重要的生物模块。结果显示了6个生物模块（N1-N6）在所有筛选的CLL患者样本中都受到了影响。而后对这些模块进行富集分析，并量化了每个PG中每个模块。正如预期的那样，两个12染色体亚组Tris12M-PG和Tris12U-PG显示出位于12号染色体上的蛋白质和参与BcR信号传导（N2）的蛋白质水平升高。进一步评估了这种上调对离体药物反应的功能，发现Tris12M-PG和Tris12U-PG对BcR通路抑制剂（例如伊布替尼）明显更敏感。    尽管相似，但Tris12M-PG和Tris12U-PG之间也在生物学上存在相关的差异，取决于IGHV的突变背景。参与趋化因子和细胞因子信号转导蛋白的模块（N6）在Tris12U-PG中明显更丰富。通过调整没有12染色体的病例中U-CLL/M-CLL的差异，发现在12染色体的背景下，U-CLL病例表现出MAPK信号蛋白水平增加，而M-CLL病例中细胞粘附分子水平增加。还可以识别M-CLL和U-CLL之间BcR信号通路的差异。对于U-CLL，12染色体表现出该通路的细胞内成分进一步增加（如NFKB1、MAPK13），而M-CLL，12染色体表现出膜结合成分的增加（如CD21、CD79A/B）。同时在磷酸化水平上也很明显，其中膜结合蛋白和膜近端蛋白在Tris12M-PG中表现出磷酸化的增加（如CD19，LYN），细胞内成分（如MAP2K2、NFATC2、AKT2）的磷酸化水平升高。作者进一步试图研究12染色体对M-CLL和U-CLL的自然病程的影响，不依赖于任何治疗环境，以首次治疗的时间（TTFT）为终点。12染色体没有改变U-CLL患者的TTFT，但显著降低了M-CLL患者的TTFT。在620例未经治疗的CLL患者队列中得到证实。在463例统一使用伊布替尼治疗的CLL患者队列中，未观察到Tris12M-PG患者的快速进展。对于接受伊布替尼作为一线治疗和复发治疗的患者也是如此。然而，12染色体患者在体内和体外对伊布替尼有更好的反应。因此，作者假设12染色体患者对BcR抑制剂的更好的反应平衡了未治疗的Tris12M-PG患者观察到的快速进展情况。 
    总结：作者应用了基于深度质谱的蛋白质组学，使用HiRIEF分馏和数据依赖性采集，彻底表征CLL的疾病生物学，然后采用DIA蛋白质组学来验证以前未知的癌症亚组。对CLL的综合多组学分析全面概述了基因变化，转录组和蛋白质组之间的相互作用，以及药物反应和临床结果的功能内容。