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「青莲聚焦」肺癌研究中利用蛋白组学布局5-10分文章
人阅读 发布时间：2022-11-21 14:16
肺癌是常见的癌症类型之一，绝大部分病例确认诊断时已发生转移，无法进行手术切除，导致五年生存期不足20%，而IV期病人五年存活率仅有6%。因其高发病率和高致死率，肺癌已经成为了人类生命健康的重要威胁。靶向治疗和免疫治疗的快速发展带来了新的方法，但目前仍受制于有限的生物标志物和治疗组合方式。基于高通量测序技术的发展，人们对肺癌有了更多的认识，揭示了很多与肺癌密切相关的基因突变。然而，越来越多的证据显示，肿瘤的发生发展并不是简单的基因突变的集合。肿瘤组织出现异常的直接原因是执行功能的蛋白质发生了异常变化，而这些异常并不能在基因层面被完全反映出来。药物作用的直接靶点都是蛋白质，而非基因。检测基因也是旨在能够间接反映出其对应蛋白质层面的功能信息。随着现代质谱的发展，科学家们可以直接测定药物真正靶向的分子，即蛋白组。蛋白组分析的一个重要特点是不但能分析样本组织中的癌细胞，还包括其中的间质和浸润免疫细胞。从而可以提供更加完整的分子表型全景图，帮助人们从整体的角度理解肿瘤的特征。因此，直接检测临床肿瘤样品的蛋白质组，是未来研究的必然趋势。那么，接下来通过几篇文献一起看看蛋白质组学在肺癌方面的应用。
前沿文献 PART 01蛋白生物标志物有助于疾病的早期诊断、疗效评估、为治疗和预后判断提供指导。运用蛋白质组学在临床病人体液或组织中，寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。尿液样本的易于获得的、无创收集和广泛的诊断目标使得尿液分析非常适合临床（PoC）监测应用。在疾病早期阶段，机体尚能代偿的时候，血液受机体稳态机制的控制，疾病早期难以产生稳定的变化，而在这个过程中，尿液以各种形式收集血液在稳态机制控制下排除出的废物，其中包括很多疾病相关的变化。因此相较于目前临床检测常用的血液样本，尿液样本具有完全无创，可连续收集、更容易检测低丰度蛋白、早期发现、检测敏感、特异性强等诸多优势。
标题：Urine Proteome Profiling Predicts Lung Cancer from Control Cases and Other Tumors
期刊：EBioMedicine（IF =11.205）
文章摘要：
技术策略：收集的健康个体（n = 33）、良性肺部疾病（n = 40）、肺癌（n = 33）、膀胱癌（n = 17）、宫颈癌（n = 25）、结直肠癌（n = 22）、食道癌（n = 14）和胃癌（n = 47）患者的231份人类尿液样本进行了非标蛋白质组学分析，通过随机森林建模，筛选出一份可以将肺癌与其他病例分开的尿液蛋白质列表。通过特征选择算法，选择了一组五种尿液生物标志物，并建立了一个组合模型，可以在训练组（n = 46）和测试组（n = 14-47每组）中正确分类大多数肺癌病例。
结果速递：
蛋白组学鉴定并定量了尿液样本中7408种蛋白质，通过差异筛选与丰度筛选，选择了68种相对丰度可在超过70%的肺癌尿液标本中检测到的蛋白作为候选蛋白质。而后构建随机森林模型（预测模型通过特征算法选择了 5 种蛋白质FTL、MAPK1IP1L、FGB、RAB33B 和 RAB15），为了评估预测的准确性，在由10名健康对照和10名年龄和性别匹配的肺癌患者组成的独立验证集上进行测试，预测模型能够正确分类9个尿液样本和9个健康对照。五种临床使用的肿瘤标志物（AFP，CA 19-9，CA 125，CA 15-3和CEA），33名肺癌患者中有8名患者血液中的标志物表达水平显示正常，表明使用这些标志物的假阴性率很高，而模型中的蛋白质FTL具有佳的判别力，AUC为0.9073。
由于只有极少数研究评估了生物标志物在将肺癌与其他疾病进行分类方面的特异性。为了评估癌症特异性，作者在其余数据集预测模型对肺癌病例的分类情况。分别对BC、CCA、CRC、EC和GC的LC进行分类，误差为18%、13.8%、20%、6.4%和12.5%。说明该模型能够在所有测试集中以高灵敏度（>93%）将肺癌与其他癌症区分开来。单个标志物FTL可以在5个测试组中将LC与其他癌症区分开来，AUC>0.81。与其他四个标志物相比，FTL是重要的标志物。五种尿液生物标志物的组合不仅可以区分肺癌患者和对照组，还可以将肺癌与其他常见肿瘤区分开来。生物标志物指标和预测模型在多环境通过更多样本验证时，可与肺癌检测的成像技术一起用作辅助诊断工具。
前沿文献 PART 02基于质谱（MS）的蛋白质组学可以对复杂的生物系统（如细胞、组织或血浆）进行大规模分析。使用现代高分辨率质谱仪和的样品制备工作流程，可以并行检测与定量数千种蛋白质，包括丰度较低的蛋白质，从而更好地了解癌症中的分子相互作用和信号通路。小细胞肺癌（SCLC）分子亚型主要基于以下关键转录调节因子的表达模式进行表征：ASCL1（SCLC-A），NEUROD1（SCLC-N），POU2F3（SCLC-P）和YAP1（SCLC-Y）。作者针对性研究了这些分子亚群的蛋白质组学景观，旨在鉴定具有诊断和治疗相关性的新亚型特异性蛋白质。
标题：In-depth proteomic analysis reveals unique subtype-specific signatures in human small-cell lung cancer
期刊：Clinical and Translational Medicine（IF =8.554）
文章摘要：
技术策略：使用人SCLC细胞系（26种细胞系），采用数据独立采集（DIA）质谱法对样品进行定量测量，评估细胞沉淀（CP）和培养基（CM）定量了近9000种蛋白质。与现有转录组学数据集相结合，旨在更清楚地定义SCLC亚型，提供对其控制治疗反应的特征见解。
结果速递：1、SCLC细胞系通过基于MS的蛋白质组学分为四种不同的亚型通过蛋白质组学检测 SCLC 细胞系的分子异质性，表征了来自人原发性或转移性SCLC病变的26种细胞系， 使用DIA蛋白质组学技术分析，共鉴定定量了 10161 种蛋白质。根据关键基因ASCL1，NEUROD1，POU2F3和YAP1的表达，将细胞系分为四个相应的亚组，这些转录因子在其各自的亚型中也显示出蛋白质水平的增加。通过比较具有不同特性（如培养类型，细胞系起源和化疗）的细胞系之间的神经内分泌（NE）特征和上皮间充质转化（EMT）特征评分，发现贴壁细胞系的NE评分明显低于非贴壁细胞系。此外，NE和EMT评分之间存在显著的负相关。培养过程中细胞系也显示出显著不同的生长特征，在26个细胞系中，10个（38.5%）悬浮生长，3个（11.5%）半贴壁形式生长，另外13个（50.0%）贴壁形式生长。贴壁和非贴壁细胞系显示出明显不同的蛋白质表达谱，结合差异蛋白与KEGG富集分析情况均证明了蛋白质水平上的表型细胞系差异。对CP样品进行无监督的共识聚类。分析揭示了蛋白质组数据中的四个聚类，与基于mRNA的分型相一致。
2、蛋白质组学分析确定 SCLC 亚型的潜在诊断标志物和成药靶标除差异表达分析外，分别对 CP 和 CM 进行 sPLS-DA，根据其表达模式鉴定适合亚型分类的蛋白质。分析结果是104种蛋白质在至少两种亚型之间显示出明显不同的特征。数据概述了六种在亚型中显示出显著丰度差异的蛋白质，同时也是FDA批准的药物靶标，即DDC（在SCLC-A中过表达），EPHA2，ITAV和ITB1（对应于基因EPHA2，ITGAV和ITGB1，在SCLC-Y中过表达），HDAC1（在SCLC-Y中下调）和KIT（在SCLC-P中上调）。这些标志物可能有助于未来的亚型诊断。
前沿文献 PART 03通常情况下，蛋白质组学分析的做法是处理新鲜冷冻的肿瘤组织。然而，由于新鲜冷冻标本的肿瘤收集在总样本数量方面会受到限制，并且这些样品往往缺乏足够长的随访信息，导致了其实际的研究意义受限。因此，福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 标本因其长期的稳定性与含有临床结果的常见信息等优势，成为回顾性研究中十分有吸引力的资源。
标题：Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories
期刊：NatureCommunications（IF =17.694）
文章摘要：
技术策略：评估了蛋白质组学在FFPE肺组织上关于蛋白质提取，定量，预分析和样本量的可行性。1、比较蛋白质提取方案，使用性能较佳的方案从肺鳞状细胞和腺癌中深度检测（磷酸化）蛋白质组，具有>8000个定量蛋白质和>14000个磷酸化位点2、通过微量蛋白组学方法，能够分析组织量有限的FFPE活检。3、研究了分析前变量（包括固定时间和热辅助去交联）对蛋白质提取效率和蛋白质组覆盖率的影响。改进的工作流程为肺癌中相关的癌基因、肿瘤抑制因子和信号通路提供了有关蛋白质丰度和磷酸化调控的定量信息。
结果速递：首先比较了三种已发表的从 FFPE 样品中提取蛋白质的方案，由整体蛋白质组覆盖率、肺癌相关的蛋白质组覆盖率以及四次重复的高可重复性等方面的结果表明 ，SDS-SP3在三种测试方案中从肺癌 FFPE 样本中提取蛋白质的效果佳。
其次，对新鲜冷冻与福尔马林固定标本的蛋白质组进行直接比较，结果显示蛋白质鉴定没有重大差异，其对蛋白质鉴定质量的影响很小。使用新鲜制备的福尔马林固定细胞进行的细胞系实验也显示，与新鲜冷冻材料相比，蛋白质组和磷酸蛋白质组覆盖率只有很小的差异。表明对于大型临床 FFPE 队列的蛋白质组学分析的研究设计，固定时间不一定是选择标准。同时 TMT 技术可以成功应用于临床 FFPE 样本，提供有关蛋白质表达和磷酸化水平的相关信息。并且TMT方法非常适合对切除的 FFPE 组织进行研究，通过优化 TMT 技术使得即使是少量样本也能实现深度蛋白质组覆盖。对于切片的 FFPE 组织，通过 TMT 实验可以定量检测到 8000多种蛋白质和超过14000 个磷酸化位点。
之后对常用 FFPE 蛋白质提取方案、蛋白质组学量化方法和不同 FFPE 样本类型的样本量要求进行系统比较，指出LFQ 只需要少量的样本进行蛋白质组分析，样本制备时间相对较短，在质谱仪上每个样品的测量时间少。因此，LFQ 特别适合研究中等覆盖率的数百个样本的大型队列。然而，对于磷酸化蛋白质组分析，由于对每个样本的样本量要求相对较高，该方法受到限制。TMT 方法可提供更深的蛋白质组和磷酸化蛋白质组，但考虑到用于标记、分级和脱盐的额外样品处理步骤，需要相对较高的样本量和更多的样本制备时间。而微尺度 TMT 方法的一个明显优势就是它提供了对蛋白质组和磷酸蛋白质组水平的深入覆盖的同时，又不需要较高的样本量，从而能够对非常小的临床标本（例如针芯活检）进行全面的蛋白质组学表征。
整体而言，质谱驱动的蛋白质组学LFQ 和 TMT 中常用的量化方法在分析 FFPE 组织方面都有不同的应用，各自具有不同的优势和劣势，并在功能蛋
前沿文献 PART 01蛋白生物标志物有助于疾病的早期诊断、疗效评估、为治疗和预后判断提供指导。运用蛋白质组学在临床病人体液或组织中，寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。尿液样本的易于获得的、无创收集和广泛的诊断目标使得尿液分析非常适合临床（PoC）监测应用。在疾病早期阶段，机体尚能代偿的时候，血液受机体稳态机制的控制，疾病早期难以产生稳定的变化，而在这个过程中，尿液以各种形式收集血液在稳态机制控制下排除出的废物，其中包括很多疾病相关的变化。因此相较于目前临床检测常用的血液样本，尿液样本具有完全无创，可连续收集、更容易检测低丰度蛋白、早期发现、检测敏感、特异性强等诸多优势。
期刊：EBioMedicine（IF =11.205）
文章摘要：
技术策略：收集的健康个体（n = 33）、良性肺部疾病（n = 40）、肺癌（n = 33）、膀胱癌（n = 17）、宫颈癌（n = 25）、结直肠癌（n = 22）、食道癌（n = 14）和胃癌（n = 47）患者的231份人类尿液样本进行了非标蛋白质组学分析，通过随机森林建模，筛选出一份可以将肺癌与其他病例分开的尿液蛋白质列表。通过特征选择算法，选择了一组五种尿液生物标志物，并建立了一个组合模型，可以在训练组（n = 46）和测试组（n = 14-47每组）中正确分类大多数肺癌病例。
结果速递：
蛋白组学鉴定并定量了尿液样本中7408种蛋白质，通过差异筛选与丰度筛选，选择了68种相对丰度可在超过70%的肺癌尿液标本中检测到的蛋白作为候选蛋白质。而后构建随机森林模型（预测模型通过特征算法选择了 5 种蛋白质FTL、MAPK1IP1L、FGB、RAB33B 和 RAB15），为了评估预测的准确性，在由10名健康对照和10名年龄和性别匹配的肺癌患者组成的独立验证集上进行测试，预测模型能够正确分类9个尿液样本和9个健康对照。五种临床使用的肿瘤标志物（AFP，CA 19-9，CA 125，CA 15-3和CEA），33名肺癌患者中有8名患者血液中的标志物表达水平显示正常，表明使用这些标志物的假阴性率很高，而模型中的蛋白质FTL具有佳的判别力，AUC为0.9073。
由于只有极少数研究评估了生物标志物在将肺癌与其他疾病进行分类方面的特异性。为了评估癌症特异性，作者在其余数据集预测模型对肺癌病例的分类情况。分别对BC、CCA、CRC、EC和GC的LC进行分类，误差为18%、13.8%、20%、6.4%和12.5%。说明该模型能够在所有测试集中以高灵敏度（>93%）将肺癌与其他癌症区分开来。单个标志物FTL可以在5个测试组中将LC与其他癌症区分开来，AUC>0.81。与其他四个标志物相比，FTL是重要的标志物。五种尿液生物标志物的组合不仅可以区分肺癌患者和对照组，还可以将肺癌与其他常见肿瘤区分开来。生物标志物指标和预测模型在多环境通过更多样本验证时，可与肺癌检测的成像技术一起用作辅助诊断工具。
前沿文献 PART 02基于质谱（MS）的蛋白质组学可以对复杂的生物系统（如细胞、组织或血浆）进行大规模分析。使用现代高分辨率质谱仪和的样品制备工作流程，可以并行检测与定量数千种蛋白质，包括丰度较低的蛋白质，从而更好地了解癌症中的分子相互作用和信号通路。小细胞肺癌（SCLC）分子亚型主要基于以下关键转录调节因子的表达模式进行表征：ASCL1（SCLC-A），NEUROD1（SCLC-N），POU2F3（SCLC-P）和YAP1（SCLC-Y）。作者针对性研究了这些分子亚群的蛋白质组学景观，旨在鉴定具有诊断和治疗相关性的新亚型特异性蛋白质。
期刊：Clinical and Translational Medicine（IF =8.554）
文章摘要：
技术策略：使用人SCLC细胞系（26种细胞系），采用数据独立采集（DIA）质谱法对样品进行定量测量，评估细胞沉淀（CP）和培养基（CM）定量了近9000种蛋白质。与现有转录组学数据集相结合，旨在更清楚地定义SCLC亚型，提供对其控制治疗反应的特征见解。
结果速递：1、SCLC细胞系通过基于MS的蛋白质组学分为四种不同的亚型通过蛋白质组学检测 SCLC 细胞系的分子异质性，表征了来自人原发性或转移性SCLC病变的26种细胞系， 使用DIA蛋白质组学技术分析，共鉴定定量了 10161 种蛋白质。根据关键基因ASCL1，NEUROD1，POU2F3和YAP1的表达，将细胞系分为四个相应的亚组，这些转录因子在其各自的亚型中也显示出蛋白质水平的增加。通过比较具有不同特性（如培养类型，细胞系起源和化疗）的细胞系之间的神经内分泌（NE）特征和上皮间充质转化（EMT）特征评分，发现贴壁细胞系的NE评分明显低于非贴壁细胞系。此外，NE和EMT评分之间存在显著的负相关。培养过程中细胞系也显示出显著不同的生长特征，在26个细胞系中，10个（38.5%）悬浮生长，3个（11.5%）半贴壁形式生长，另外13个（50.0%）贴壁形式生长。贴壁和非贴壁细胞系显示出明显不同的蛋白质表达谱，结合差异蛋白与KEGG富集分析情况均证明了蛋白质水平上的表型细胞系差异。对CP样品进行无监督的共识聚类。分析揭示了蛋白质组数据中的四个聚类，与基于mRNA的分型相一致。
2、蛋白质组学分析确定 SCLC 亚型的潜在诊断标志物和成药靶标除差异表达分析外，分别对 CP 和 CM 进行 sPLS-DA，根据其表达模式鉴定适合亚型分类的蛋白质。分析结果是104种蛋白质在至少两种亚型之间显示出明显不同的特征。数据概述了六种在亚型中显示出显著丰度差异的蛋白质，同时也是FDA批准的药物靶标，即DDC（在SCLC-A中过表达），EPHA2，ITAV和ITB1（对应于基因EPHA2，ITGAV和ITGB1，在SCLC-Y中过表达），HDAC1（在SCLC-Y中下调）和KIT（在SCLC-P中上调）。这些标志物可能有助于未来的亚型诊断。
期刊：NatureCommunications（IF =17.694）
文章摘要：
技术策略：评估了蛋白质组学在FFPE肺组织上关于蛋白质提取，定量，预分析和样本量的可行性。1、比较蛋白质提取方案，使用性能较佳的方案从肺鳞状细胞和腺癌中深度检测（磷酸化）蛋白质组，具有>8000个定量蛋白质和>14000个磷酸化位点2、通过微量蛋白组学方法，能够分析组织量有限的FFPE活检。3、研究了分析前变量（包括固定时间和热辅助去交联）对蛋白质提取效率和蛋白质组覆盖率的影响。改进的工作流程为肺癌中相关的癌基因、肿瘤抑制因子和信号通路提供了有关蛋白质丰度和磷酸化调控的定量信息。
结果速递：首先比较了三种已发表的从 FFPE 样品中提取蛋白质的方案，由整体蛋白质组覆盖率、肺癌相关的蛋白质组覆盖率以及四次重复的高可重复性等方面的结果表明 ，SDS-SP3在三种测试方案中从肺癌 FFPE 样本中提取蛋白质的效果佳。
其次，对新鲜冷冻与福尔马林固定标本的蛋白质组进行直接比较，结果显示蛋白质鉴定没有重大差异，其对蛋白质鉴定质量的影响很小。使用新鲜制备的福尔马林固定细胞进行的细胞系实验也显示，与新鲜冷冻材料相比，蛋白质组和磷酸蛋白质组覆盖率只有很小的差异。表明对于大型临床 FFPE 队列的蛋白质组学分析的研究设计，固定时间不一定是选择标准。同时 TMT 技术可以成功应用于临床 FFPE 样本，提供有关蛋白质表达和磷酸化水平的相关信息。并且TMT方法非常适合对切除的 FFPE 组织进行研究，通过优化 TMT 技术使得即使是少量样本也能实现深度蛋白质组覆盖。对于切片的 FFPE 组织，通过 TMT 实验可以定量检测到 8000多种蛋白质和超过14000 个磷酸化位点。
之后对常用 FFPE 蛋白质提取方案、蛋白质组学量化方法和不同 FFPE 样本类型的样本量要求进行系统比较，指出LFQ 只需要少量的样本进行蛋白质组分析，样本制备时间相对较短，在质谱仪上每个样品的测量时间少。因此，LFQ 特别适合研究中等覆盖率的数百个样本的大型队列。然而，对于磷酸化蛋白质组分析，由于对每个样本的样本量要求相对较高，该方法受到限制。TMT 方法可提供更深的蛋白质组和磷酸化蛋白质组，但考虑到用于标记、分级和脱盐的额外样品处理步骤，需要相对较高的样本量和更多的样本制备时间。而微尺度 TMT 方法的一个明显优势就是它提供了对蛋白质组和磷酸蛋白质组水平的深入覆盖的同时，又不需要较高的样本量，从而能够对非常小的临床标本（例如针芯活检）进行全面的蛋白质组学表征。
整体而言，质谱驱动的蛋白质组学LFQ 和 TMT 中常用的量化方法在分析 FFPE 组织方面都有不同的应用，各自具有不同的优势和劣势，并在功能蛋
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