标题：TMT-Based Quantitative Proteomics Analysis Reveals the Panoramic Pharmacological Molecular Mechanism of β-Elemonic Acid Inhibition of Colorectal Cancer.期刊：Frontiers in Pharmacology（IF =5.988）

时间：2022.08

 

背景

结直肠癌（CRC）是全球第四大致命恶性肿瘤，常见的治疗方法是手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗。尽管CRC诊断和治疗取得了进展，但预后仍然很差，副作用和毒性反应的发生严重限制了这些疗法的临床治疗应用。因此，开发创新的抗癌方法对于预防和治疗CRC是必要的。植物来源的小分子化合物，如紫杉醇等已被广泛研究和应用于癌症预防和治疗。β-柠檬酸（EA）因其抗炎和抗癌功能而闻名。据报道，EA 通过消耗谷胱甘肽、下调Bcl-2、上调Bax和抑制 MAPK 信号通路来提高活性氧 （ROS） 水平，从而诱导肺癌 A549 细胞的凋亡。已知EA 可通过衰减 JAK2/STAT3/MCL-1 和 NF-κB 信号通路来抑制前列腺癌细胞的生长，触发去势抵抗性前列腺癌细胞的凋亡。对CRC的左右仍是未知。

 

文章重点

首次报道了EA对结直肠癌细胞的抑制作用及其全面的药理网络机制。EA是一种有效的抗癌化合物，以浓度依赖性的方式抑制许多线粒体核糖体蛋白和细胞周期蛋白的翻译。靶向线粒体和诱导铁死亡是EA抑制癌症的两大亮点。

 

研究内容

01 β-柠檬酸抑制结直肠癌细胞增殖

体外作者通过细胞计数（CCK8）测定显示EA以浓度与时间依赖性的方式抑制了结直肠癌细胞SW480、HCT116和HT29，而正常的结直肠细胞系NCM460对EA的敏感性较低。通过对EA处理SW480细胞的形态变化研究发现细胞形态随EA浓度的增加而改变，当EA浓度高于15μg/ml时，SW480细胞延伸不足，当EA浓度达到25μg/ml时，细胞变圆。此外，EA还以浓度依赖性方式抑制SW480细胞的集落形成。伤口愈合测定显示，EA以浓度依赖性的方式抑制SW480细胞的迁移。

 

 

体内实验作者通过异种移植模型评估显示，EA治疗的皮下肿瘤明显小于DMSO治疗的皮下肿瘤。EA治疗组与对照组小鼠体重无显著差异。然而，前者的肿瘤重量明显低于后者。虽然H&E染色结果未显示EA处理组与对照组有明显差异，IHC染色显示，与对照组相比，EA治疗组的Ki67水平降低。此外，H&E染色未显示EA治疗组与对照组的肾脏，肝脏或心脏切片之间存在任何差异，表明EA对小鼠的毒性较低。

 

02 β-柠檬酸抗肿瘤机制的蛋白质组学分析

蛋白质组学针对EA治疗组和对照组，差异指标使用FC>1.2（或<0.83）和p < 0.05作为卡值标准，在EA处理组中发现了870种差异蛋白。其中，430个位于细胞核中，209个位于细胞质中，159个位于线粒体中，122个位于细胞膜中，106个位于细胞外基质中。火山图显示，线粒体核糖体蛋白（MRPL3、MRPS11、MRPL13、MRPL37、MRPS18A和MRPL28）和细胞周期相关蛋白（CDK1、CDK6、CDC20、AURKAIP1和RRM2）在EA治疗组。GO功能注释显示，代表线粒体蛋白相关途径（翻译终止和伸长）和生物过程的基因显著富集。此外，许多线粒体核糖体蛋白在CRC组织中高表达，但在正常组织中没有，表明其可能是EA的主要靶标。此外，线粒体膜电位测定结果显示EA治疗组SW480细胞的线粒体膜电位显著降低。总体而言，EA通过减弱线粒体核糖体蛋白的翻译来抑制CRC细胞增殖。

03 β-柠檬酸抑制结直肠癌细胞周期

在检查DNA合成时，发现EA以浓度依赖性方式显著抑制了SW480细胞的DNA合成并降低了其增殖速率。流式细胞术显示，EA以浓度依赖性方式显著抑制S期和G2期，但不影响G1期。值得注意的是，浓度为20μg/ml的EA显著增加了亚G1期细胞的百分比，表明诱导CRC细胞死亡。

04 β-柠檬酸诱导的结直肠癌非凋亡性死亡

采用钙黄绿素AM/PI双染色法验证EA诱导CRC SW480细胞死亡。15μg/ml导致少量细胞死亡，而30μg/ml导致大量细胞死亡（死细胞PI阳性染色）。膜联蛋白V-FTC/PI双染色显示EA以浓度依赖性方式诱导细胞死亡。流式细胞术显示EA增加了膜联蛋白-V和PI的荧光强度，但没有增加膜联蛋白-V阳性/PI阴性象限，提示非凋亡性细胞死亡。

05 β-柠檬酸诱导的结直肠癌细胞铁死亡

KEGG富集分析显示，EA 治疗组中铁蛋白（FTL）下调和铁氧化物酶 （CP）、转铁蛋白（TF）和酰基辅酶A合成酶长链家族成员 4（ACSL4）上调，提示 EA 可能引发铁死亡。使用铁生长抑制剂铁抑素-1证实了结果，该抑制剂部分有效地挽救了EA抑制的CRC细胞活性。此外，发现EA显著增加了SW480细胞，细胞内铁浓度升高，在IF染色的SW480细胞中改变和增强LC3，并在异种移植模型中降低FTL。FTL的主要功能是储存可溶性和无毒的铁，而LC3介导的FTL降解导致铁释放。作者还利用在线大数据平台分析了TF、CP和FTL在CRC中的表达。结直肠癌组织中TF和CP水平显著低于正常组织，而FTL组织显著高于正常组织。因此，FTL水平的增加以及TF和CP水平的降低可能与CRC的发生呈正相关，而EA通过下调FTL和上调TF和CP来改善恶性肿瘤。此外，由于TF的上调，细胞内铁浓度增加，这可能有助于促进铁死亡。

总结：

EA是一种具有生物活性的植物衍生化合物，其抗癌特性先前已有报道。然而，对其药理作用和对CRC的影响知之甚少。本文揭示了EA在CRC体外和体内的抑制作用，并研究了高通量蛋白质组学与传统分子技术相结合的潜在分子机制。结果表明，EA减少了CRC SW480细胞。在低浓度（低于15μg/ ml）下，EA主要通过下调CDK1，CDK6和CDC20来抑制细胞周期；而在高浓度（高于 15 μg/ml）下，EA 通过上调 TF、CP 和 ACSL4 以及下调 FTL来诱导铁死亡。