在癌症的发展过程中，营养受限的情况很常见。细胞葡萄糖水平和细胞存活的协调是细胞生物学中的一个基本问题，目前尚未完全了解。已知4EBP1是一种翻译抑制因子，通过控制翻译起始来调节细胞的增殖和存活。然而，除了翻译抑制功能外，4EBP1是否还通过其他机制参与肿瘤的生存，尤其是在葡萄糖饥饿条件下仍然未知。2022年12月27日，来自南昌大学的王建斌教授研究团队在Cell Death & Disease杂志（IF 9.685）上在线发表了题为“4EBP1 senses extracellular glucose deprivation and initiates cell death signaling in lung cancer”的研究论文，该研究利用蛋白质组学技术（青莲提供技术支持）揭示了4EBP1作为一种新的细胞葡萄糖传感器在葡萄糖饥饿条件下调节癌细胞死亡的新机制，这与它作为翻译抑制因子的经典功能不同。   

研究背景

为了获得足够的能量和代谢物来支持细胞的快速生长和增殖，癌细胞会进行代谢重编程。葡萄糖是关键营养素之一，癌细胞吸收和代谢葡萄糖的程度远高于正常细胞。在实体瘤的快速增殖过程中，由于血管生成不足，肿瘤的中心区域总是出现葡萄糖供应不足。葡萄糖饥饿 (GS) 可根据遗传、表观遗传和环境线索触发不同癌细胞类型的细胞凋亡、坏死、自噬或细胞生长停滞。然而，细胞如何应对这些细胞外变化以及葡萄糖剥夺诱导细胞死亡的分子机制尚未完全确定。 

研究结果

GS诱导NSCLC细胞中4EBP1的去磷酸化和稳定为了探究中心区肿瘤细胞死亡的分子机制，作者分离了来自两名肺腺癌患者的肿瘤中心区和外周区，并进行了蛋白质组学分析。结果显示，与肿瘤外周区域相比，肿瘤中心区域有377种蛋白质上调，275种蛋白质下调（图1A）。对上调蛋白进行KEGG富集分析，发现长寿调节通路在前20个信号通路中富集比高，且变化显著（图1B）。有趣的是，在该通路中4EBP1基因差异大。4EBP1在肿瘤周边区域的蛋白表达几乎检测不到，而4EBP1在中心区域显示出相对高的表达，WB也验证了该结果（图1C）。因此，作者怀疑4EBP1可能在肿瘤中心区域的细胞死亡进程中发挥关键作用。此外中心区域的葡萄糖水平远低于外周区域（图1D），因此作者研究了4EBP1是否可以响应NSCLC中的GS。结果表明GS降低了4EBP1的磷酸化水平并通过抑制其K48连接的泛素化稳定了4EBP1。   PTPMT1在GS条件下去磷酸化并稳定4EBP1为了进一步阐明GS下4EBP1的调控机制，作者通过质谱分析找出4EBP1的磷酸酶。免疫共沉淀实验表明，PTPMT1与4EBP1间具有相互作用（图2A），并且在GS下这种相互作用增强（图2B）。进一步检查了Phos-Tag凝胶上4EBP1的磷酸化水平。图2C显示过表达PTPMT1降低了4EBP1的磷酸化，表明PTPMT1是4EBP1的磷酸酶。接下来，作者检测了PTPMT1对4EBP1表达的影响。过表达PTPMT1上调了4EBP1的表达水平（图2D），而敲低PTPMT1降低了4EBP1表达水平（图2E）。接下来检测了当PTPMT1过表达时，A549细胞核和细胞质中4EBP1的蛋白水平。有趣的是，总的4EBP1和低磷酸化的4EBP1的蛋白水平在细胞质中显著增加，而在细胞核中仅略有下降(图2G)。这些结果表明，PTPMT1与4EBP1相互作用，然后在细胞核内使4EBP1去磷酸化，导致4EBP1移位到细胞质中。此外还检测了在GS条件下PTPMT1基因敲除后4EBP1的泛素化和蛋白水平。结果显示，PTPMT1基因敲除可以恢复4EBP1泛素化水平的降低(图2O)，并减弱GS诱导的4EBP1蛋白上调(图2P)。综上结果表明，PTPMT1通过阻止4EBP1在GS条件下被泛素介导的蛋白酶体降解，使4EBP1去磷酸化并稳定。    4EBP1在GS条件下通过失活STAT3诱导细胞凋亡STAT3是一种重要的转录因子，可调节一系列抗细胞凋亡基因（bclxl、bcl2、Survivin、MCL-1等）以介导细胞存活。STAT3在Y705位点的磷酸化导致其二聚化、核转位、DNA结合和转录起始。因此，作者评估了p-STAT3-Y705在肺癌中心区和周边区的表达。研究发现，与肿瘤周边区域相比，中心区域的p-STAT3蛋白水平较低(图3A),与4EBP1的蛋白水平完全相反，表明4EBP1可能与STAT3相关。进一步研究了4EBP1被敲低时p-STAT3-Y705在A549细胞中的表达(图3C),结果表明，在GS条件下，敲低4EBP1使STAT3的磷酸化水平增加。有趣的是，当4EBP1被敲低时，p-STAT3-Y705和STAT3在细胞核中的表达增加，而在GS条件下，STAT3的蛋白水平在细胞质中降低(图3D)。这些数据表明，在GS条件下，敲低4EBP1可诱导STAT3从细胞质向细胞核的磷酸化和易位，并促进抗凋亡基因的表达。  4EBP1在体内GS条件下抑制肿瘤进展为了阐明4EBP1在肿瘤进展中的作用，作者构建了4EBP1基因敲除的A549稳定细胞系(A549-sh4EBP1)，并进行了异种移植实验。MTT测定显示，由GS诱导的细胞死亡在A549-sh4EBP1细胞中被挽救（图4B），形态学观察也得到类似结果（图4C）。流式细胞仪分析表明，在GS条件下，A549-sh4EBP1细胞的凋亡数明显低于亲本A549细胞(图4D)。与亲本A549细胞相比，A549-sh4EBP1细胞的移植瘤大小和重量都有所增加(图4E，F)。为了证实上述结果，采用免疫组织化学方法检测了肿瘤中心葡萄糖供应不足区域的细胞凋亡标志物的表达。与亲本A549细胞移植瘤中心区相比，A549-sh4EBP1细胞移植瘤中心区p-STAT3-Y705及抗凋亡基因显著增加，表明了4EBP1基因敲除的异种移植瘤细胞凋亡减少。这些结果进一步表明，4EBP1抑制了GS条件下的肿瘤进展。  

小结

该研究首次发现4EBP1在葡萄糖饥饿条件下可以调节癌细胞的死亡。葡萄糖饥饿诱导非小细胞肺癌(NSCLC)细胞总4EBP1蛋白表达上调，并伴随由高磷酸化状态向低磷酸化状态的转变。PTPMT1(磷酸酶)在此过程中去磷酸化并稳定4EBP1。此外，4EBP1与STAT3(信号转导和转录激活因子-3)相互作用，阻止JAK或ERK磷酸化和激活STAT3，导致抗凋亡基因的表达减少，从而导致细胞凋亡。综上所述，这些发现阐明了4EBP1在葡萄糖饥饿条件下调节细胞活力的关键作用。该研究为肿瘤治疗提供了一种新的治疗策略，即激活PTPMT1去磷酸化4EBP1，从而导致肿瘤核心区域的细胞凋亡。