细胞外囊泡作为液体活检中生物标志物的新来源，用于监测癌症的进展和耐药性展现出巨大的潜力，成为癌症诊断治疗的热点研究领域。循环细胞外囊泡（cEV）常见于体液中。cEV封装了各种货物，包括蛋白质、脂质和核酸，概括了其供体组织的分子特征。与单个部位取样的实体瘤活检相比，cEV可以提供有关转移的独特信息。今天分享两篇文献如何利用蛋白质组学技术从血清/血浆循环细胞外囊泡评估结直肠癌诊断的生物标志物。

目前，结直肠癌肝转移（CRLM）的分子风险分层基于组织病理学评估和源自肿瘤活检的疾病驱动基因。而液体活检，即循环肿瘤衍生材料的非侵入性分析，可以提供有关疾病的独特信息，此外可以监测肿瘤对治疗的反应。
  来自德国研究团队于2022年4月1日在Molecular cancer（IF 41.44）上发表了题为Comprehensive proteomic profling of serum extracellular vesicles in patients with colorectal liver metastases identifes a signature for non-invasive risk stratifcation and early-response evaluation的研究成果。文章利用蛋白质组学技术评估了血液循环细胞外囊泡（cEV）特征和相关蛋白作为结直肠癌肝转移风险分层和化疗响应预测的可能性，并明确了血清细胞外囊泡蛋白（EVP）可作为CRLM术前风险分层和化疗响应预测的生物标志物。  发现队列：结直肠癌肝转移(CRLM) 56人（收集手术治疗前和治疗后血清），良性肝病（BD）7人
内部验证队列：结直肠癌肝转移(CRLM) 154人（收集手术治疗前和治疗后血清），良性肝病（BD）78人
外部验证队列：结直肠癌肝转移(CRLM) 110人
 


  研究者首先对从血清中分离得到的细胞外囊泡进行了NTA（纳米颗粒跟踪分析）粒径检测、marker蛋白的WB检测（ ITGB1、CD63、CD81和CD9 ，钙网蛋白为阴性对照）和电子显微镜检测，确认成功分离出细胞外囊泡(图1A B C)。对EVP浓度分析发现不管是CRLM组手术前还是手术后，其EVP浓度都显著高于BD组且手术前后的EVP浓度都分别与CRLM患者的总生存（OS）负相关。
 
接下来研究者对术前和术后CRLM及BD患者的血清细胞外囊泡进行了基于质谱的蛋白质组学分析，结果共鉴定到563个蛋白，其中74个蛋白在CRLM患者术前和术后存在显著差异表达（图1D）。为了评估这些蛋白是否作为CRLM的预后生物标志物，研究者通过单变量分析和LASSO-Cox分析发现了6个蛋白可以预测预后，ELISA检测显示这6个蛋白的表达和蛋白组学的结果显著相关。基于ELISA结果，研究者使用多变量Cox回归构建了一个EVP panel，包含前述6个蛋白中的4个，同时计算了风险值。高风险值的患者有更差的临床结局。
  为了识别癌症特异性EVPs，研究者采用以下标准比较了CRLM和BD的蛋白质组学结果：大于50%的样本中存在EVPs，其中CRLM比BD变化倍数大于2，FDR小于0.05，趋化因子配体7（CXCL7）和血小板反应蛋白4 （THBS4）被鉴定为CRLM中富集的EVP（图2A）。且CXCL7是手术后仅有的一个下调倍数超过2，FDR小于0.05的蛋白（图2B），表明EV CXCL7的主要来源可能是转移灶。
 研究者进一步检测了CXCL7是否可以预测化疗响应。结果表明部分缓解（PR）的患者在治疗开始2周后EV中的CXCL7水平已经出现了下降。病情无进展（SD）的患者CXCL7没有明显变化。大多数疾病进展（PD）患者在治疗开始两周后显示CXCL7升高。通过检测CXCL7的表达水平来预测PR或PD，结果显示该模型的AUC值为1，优于血清癌胚抗原CEA。综上结果表明血清细胞外囊泡CXCL7可作为结直肠癌肝转移化疗响应的早期预测性生物标志物。
结直肠癌（CRC）的早期筛查对改善其预后至关重要。液体活检由于其低侵袭性和高重复性，越来越多地被被考虑用于癌症诊断。而表达肿瘤特异性蛋白的循环细胞外囊泡（crEVs，从血浆中分离的细胞外囊泡）是各种癌症的潜在生物标志物。
来自浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所团队于2020年4月14日在Journal of Extracellular Vesicles (IF 17.337)上发表文章A circulating extracellular vesicles-based novel screening tool for colorectal cancer revealed by shotgun and data-independent acquisition mass spectrometry，利用TMT蛋白组学、磷酸化蛋白组学、DIA蛋白组学并结合PRM验证发现结直肠癌血浆游离胞外囊泡的蛋白标志物。
  Cohort1（发现队列）：10例健康者（N组），10例无转移的CRC患者（Ca组），10例有肝转移的CRC患者（M组）Cohort2（WB验证）：11例健康者（N组），11例无转移的CRC患者（Ca组），6例有肝转移的CRC患者（M组）Cohort3（WB验证）：19例健康者（N组），20例腺瘤患者（A组），19例无转移的CRC患者（Ca组），3例有肝转移CRC患者（M组）Cohort4（DIA-MS+PRM）：12例健康者（N组），13例腺瘤患者（A组），12例无转移的CRC患者（Ca组） 
TMT技术分别进行蛋白组学及磷酸化蛋白组学分析。结果共鉴定到545个蛋白，252个磷酸肽以及347个磷酸化位点。聚类分析显示三组间的蛋白表达存在差异，其中FGA，FN1，S100A9和HP的表达水平及其磷酸化位点存在显著差异（图3A、B、D）。  进一步对队列2进行WB验证这4个蛋白的表达水平。所有的蛋白均表现出显著的差异，其中纤维蛋白原A链（FGA）为主要的区分生物标志物（图3C）。为了进一步验证CRC血浆样品中FGA的过表达，又测试了队列3，发现所有CRC-EV样本（无论是否转移）均显示FGA过表达，且65%腺瘤样本也是如此。 为了确定该方法在结肠腺瘤和CRC临床筛查中的效用，作者利用DIA-MS方法对队列4（S1-S37）进行了测试。当直接检测血浆样本时，三组之间的FGA水平没有显著差异，说明血浆中不能直接检测到FGA表达的差异。随后研究人员对血浆分离的EVs样本继续研究并对DIA-MS上机时长进行优化确定20 min上机时长分析了所有crEV样品中FGA的相对丰度，发现N和A组之间以及N和Ca组之间存在显著差异，但两个患者组之间却没有显著差异。此外，ROC曲线显示FGA + crEVs可以区分CRC患者与健康对照组且具有更高的特异性和敏感性。队列4进行PRM验证，结果显示健康个体的crEV中的FGA水平较低，而CRC患者的FGA水平高，与DIA-MS检测到的差异相似。